尺度和量的概念
红细胞: 6,000-9, 000nm
白细胞: 10,000nm
一般细菌: 1,000 – 10,000 nm
一般病毒: 75 – 100 nm
蛋白质： 5 – 50 nm
DNA (双链宽) ： 2 nm
谋求灵敏、准确地在分子层面，以致在活体内，将生物分子的成分、结构、相互作用 等信息转变为易于检测的光、电等信号变化。
600
J. Huang, K. Wang, W. Tan, et al. Anal. Chem. 2010, 82, 10158
Cell aptamer
细胞膜蛋白触发构型变化的激活式核酸适体探针，用于肿瘤活体荧光成像。 检测原理示意图
创新性提出了“激活式核酸适体探针” 概念，该探针与传统 “always on”核酸适体 探针相比，有效降低了非特异性背景信号， 在肿瘤部位产生了更高的对比度并大大缩短 诊断时间，有望为实现肿瘤早期诊断提供一 种更为灵敏的检测方法。
分子信标的工作原理：
E: FRET效率 R: 荧光给体与受体之间的距离
无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和淬灭基团相互靠近，发生FRET，荧 光淬灭。加入靶序列后，分子信标环部与之互补配对形成刚性并且更稳定的 双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团距离增大，阻止FRET发生，荧光恢复。
K. Wang, W. Tan, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 856
PNAS, 2006, 113, 11838
分子信标用于果蝇卵母 细胞内mRNA成像
PNAS, 2003, 100, 13308
• CRE-decoy aptamer 治疗乳腺癌 的效果要显著地优于tamoxifen。
• 抗VEGF aptamer (Macugen) 已 被用于老年性黄斑变性的临床治 疗。
A
Molecular Beacon
Oligo A Oligo
Hybrid
B
NTFS
Binding
Ligation
B
Fluorescence Intensity
500000 400000 300000
2.3
0.23
0.115 6.9X10-2 2.3X10-2 1.2X10-2 6.9X10-3 2.3X10-3
杂交链式反应用于DNA的比色检测 --- Watson-Crick碱基互补配对
P. Liu, X. Yang, K. Wang, et al. Anal. Chem. 2013, 85, 7689−7695
Watson-Crick碱基互补配对启发的自组装构型开关用于核酸杂交调控
L. He, X. Yang, K. Wang, et al. Chem. Commun., 2014, 50, 7803--7805
核酶（Ribozyme）是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特定RNA序 列。它的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。有一些DNA分子同样具有催化功能。 1981年由Cech等人在研究四膜虫前体rRNA拼接机制时发现，并因此获得1988年诺 贝尔化学奖。
如上图，由于DNAzyme与底物链发生分子内杂交, 荧光基团与猝灭基团相互靠近, 导致荧光猝灭. 当Pb2+存在时, DNAzyme被激活, 底物链被切断后释放出荧光基团 标记的DNA片段, 从而产生明显的荧光信号. 据此可在常温下快速检测Pb2+, 检测 下限为10 nmol/L.
2.2 与蛋白酶发生特异性相互作用---核酸片段检测（NTFS） 平台技术
（Nucleic Acid Res., 2003, 31, e148; Nucleic Acid Res., 2005, 33, e97；Analyst, 2005,130,350-357; Anal. Biochem., 2006, 353, 141-143; Biomedical Photonics Handbook, 2003, p57-1~57-23, ）
•靶分子
•核酸适配体
•ATP 核酸适配体
•Designer DNA/RNA
小分子ATP aptamer Aptamer辅助的量子点自组装用于ATP的荧光传感
J. Liu, X. Yang*, K. Wang*, et al. Anal. Chem. 2013, 85, 11121−11128
肌红蛋白 aptamer 正/反筛集成的微流控芯片用于肌红蛋白aptamer的筛选
5. 与纳米结构结合，用于肿瘤等的成像和治疗研究
6. 临床应用等
核酸分子探针的进展， 已经能在单个活细胞，甚 至单分子水平上观测分子 的行为，为细胞信号转导 的活体、实时、在线研究 提供了条件。
核酸分子探针的发展 不仅促进了检测手段的变 革，还带来了巨大的经济 和社会效益。
核酸适体用于肿瘤 细胞的识别
Q. Wang, X. Yang*, K. Wang*, et al. Anal. Chem. 2014, 86, 6572−6579
溶菌酶aptamer
将aptamer序列嵌入到分子信标的互补链，与目标识别时发生竞争反应，可以 引起构型变化，分子信标恢复发夹结构，释放信号。
5x106
Fluorescence Intensity (CPS)
4x106 3x106 2x106 1x106
0 350
400
450
500
550
Wavelength (nm)
[L ysozyme] 500 nM 200 nM 100 nM 50 nM 20 nM 10 nM 5 nM 2 nM 1 nM 0.8 nM 0.5 nM 0.2 nM 0.1 nM 0 nM
杂交链式反应用于DNA的高灵敏检测 --- Watson-Crick碱基互补配对
Fluorescence Intensity (a.u.)
40
35Leabharlann 302520
15
10
5
0
350
400
450
500
550
600
650
Wavelength (nm)
J. Huang, K. Wang, W. Tan, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 401
•荷电性 •负电 •负电 •中性 •负电
•非特异性结合 •高 •高 •低 •底
•毒性 •高毒性 •低毒性 •低毒性 •无毒性
4. 核酸适配体 Aptamar----”Chemical Antibody”
Theoretically, anything we use antibodies today (for molecular recognition, molecular interaction, diagnosis, and therapeutical) can be replaced with synthetic DNA probes which can be prepared reproducibly in our labs using a DNA synthesizer.
G-quadruplex–aptamer as a drug delivery carrier
Analytical Chemistry, 2009, 81(6): 2144-2149 Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6098 –6101
2.1 作为生物催化剂（核酶）---核酶探针
1962年，沃森、克里克和威尔 金斯获得诺贝尔生理学或医学奖
D。NA双螺旋结构模型的提出标志现代分子生物学的诞生。
DNA分子的特点：
➢ 稳定性：脱氧核糖和磷酸交替 连接方式不变，碱基配对原则不变 ，可反复变性和复性。
➢ 多样性：DNA分子碱基对的排 列顺序千变万化，一天n个碱基的 DNA分子排列方式有4n种。
150000 145000 140000
0
2.3X10-3
1.2X10-3 2.3X10-4
400
800
200000
100000
0
200
400
600
800
Time (Second)
NTFS (Nucleotide Fragment Sense)平台技术实时监测核酸的连接过程 该平台还被用于核酸磷酸化过程监测，NAD等的高灵敏检测
利用E.Coli DNA连接酶具有对NAD的高度依赖性，检测NAD+
Z. Tang, K. Wang* et al. Anal. Chem., 2011, 83, 2505
基于DNA聚合酶的链置换聚合反应用于DNA的高灵敏检测
Q. Guo, X. Yang, K. Wang, et al. Nucleic Acids Res. 2009, 37, e20.
亲和力高 特异性强
筛选周期短，成本低
靶分子种类广泛
结合条件可控 修饰灵活
分子量小，无免疫原性
稳定、易保存
•核酸适配体的定义
• 核酸适配体：由15-60个碱基组成的能特异识别 靶分子的单链DNA/RNA，识别对象包括小分子 、蛋白质、细胞等。
分子识别的基础不是碱基互补配对 折叠成特定的二级与三级结构 空间结构与靶分子构象匹配
5. 与纳米结构结合，用于肿瘤等的成像和治疗研究； 6. 临床应用等
1.1 Watson-Crick碱基互补配对—分子信标
目标 DNA
分子信标是个呈发夹结构、设计十分巧妙的短链DNA分子。由于它特殊的结构，自 从1996年被首次合成出来以后，它已经被非常广泛地应用于PCR定量、基因分型、 基因芯片、活细胞内mRNA分析以及蛋白质（酶）研究等领域。
1.2 金属-碱基对
T-Hg2+-T的结构