CT-DENBA、-DUNUA-DNA 部血分清泌、物全等血。、咽拭子等
耐 葡甲 萄氧 球核西 菌林 相酸金 关提黄 基色 因取方粪物法便、：血液及各类分泌 H检HC测PM-VD煮-DN沸NAA法；胃尿全粘液血膜、等组乳织汁活、检血标清本、
H乙关MIVP肝基--1病因D柱RN毒检N提AA耐测取药；相痰血、清血咽或清拭血或子浆血等等浆 磁珠法等。
产率 (yield)
不同核酸提取方法产率比较 （通过样本浓度倍比稀释后比较灵敏度）
Journal of Virological Methods 171 (2011) 195–199。
重庆市临床检验中心
DNA核酸提取评价
纯度 (Purity)
检测260nm、280nm、(320nm)OD值，计算比值
重庆市临床检验中心
DNA核酸提取评价
产率 (yield)
不同核酸提取方法产率比较 （不同提取方法提取后Ct比较）
菌液浓度106 CFU/ml
Journal of Microbiological Methods 76 (2009) 30–37
菌液浓度105CFU/ml 重庆市临床检验中心
DNA核酸提取评价
有机提取法 盐析法 氯化铯密度梯度离心法 硅材质技术 离子交换法 滤纸分离法 …
CLSI- MM13A Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods
酶消化法 有机溶剂提取法 强变性剂提取法 酒精及氯化锂沉淀法 氯化铯及蔗糖密度梯度 离心法 离子交换层析法 硅材质技术 Oligo(dT) 亲和层析法 分离mRNA …
组织样本结合杆菌检测 不同提取方法效率比较
（检测限比较）
重庆市临床检验中心
临床病原微生物核酸提取
提取方法的选择
依据 标本类型
考虑 后续实验 对提取质 量的要求
依据
相关标准、 指南
重庆市临床检验中心
临床病原微生物核酸提取
提取方法的选择
依据治疗、监测要求选择
重庆市临床检验中心
临床病原微生物核酸提取
重庆市临床检验中心
DNA核酸提取评价
产率 (yield)
核酸定量分析方法
若不含脂肪组织，大于10mg的组织应能产出大于 10 μg的 RNA 或 DNA 。
CLSI-MM10-P Genotyping for Infectious Diseases:Identification and Characterization . CLSI- MM13A Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods.
葡萄球菌相关基因 检测
部分泌物等。 粪血便清、、血全液血及、各咽类拭分子泌等 物
HP-DNA
HCMV-DNA 乙肝病毒耐药相
关基因检测
MP-DNA
胃粘膜组织活检标本 尿液、乳汁、血清、 全血等 血清或血浆
痰、咽拭子等
HIV-1RNA 血清或血浆等
细菌其宏它…基…因组 Flu-RNA
菌液 …… 咽拭子、呼吸道分泌 物样本等
核酸提取质量保证
与自动核酸提取仪性能评价
廖璞 重庆市临床检验中心
2015 . 10 重庆
内容
引言 核酸提取质量评价与保证 自动核酸提取仪性能评价 结语
重庆市临床检验中心
引言
器官移植 配型HLA 分型检测
分子诊断
病原微生物 核酸检测
核酸提取 与纯化是
基础
分子诊断 临床应用
染色体病 和遗传性 疾病基因
重庆市临床检验中心
引言
核酸提取基本步骤
样本 预处理
裂解 释放
分离 纯化
重庆市临床检验中心
引言
核酸提取与检测结果
核酸提取、扩增过程中人基因组的污染，导致测序结果被污染
J Natl Cancer Inst. 2011 Jun 8;103(11):847-8庆市临床检验中心
核酸质量综合评价 产率 纯度
完整性 其他
其他：干扰物质、交叉污染等
重庆市临床检验中心
DNA核酸提取评价
产率 (yield)
1
核酸定量
评2
价
提取核酸后进行定量PCR，比较Ct值
方3 通过标本倍比稀释后提取进行灵敏度评价
法
4
通过内标(Internal Control/Calibrator)评价
RNA核酸提取评价
产率 (yield)
不同实验室RNA提取产率比较 （ 通过RT-qPCR对提取出的RNA进行基因转录子扩增比较提取效率）
Methods 59 (2013) 20–31
重庆市临床检验中心
RNA核酸提取评价
纯度 (Purity)
比值 R = (A260–A320)/(A280–A320)
重庆市临床检验中心
微量样本的核酸质量评价
如NanoDrop超微量分光光度计、quabit、 Quant-iT荧光定量分析–用 于下游检测为（NGS）等需要精密测定的实验
重庆市临床检验中心
主要分子诊断技术对核酸提取的要求
1 临床病原微生物核酸检测
2 染色体病和遗传性疾病基因检测
3
肿瘤基因检测
4 器官移植配型HLA基因分型检测
提取后贮存方式
重庆市临床检验中心
DNA核酸提取评价
评价方法
完整性(Integrity)
1
普通凝胶电泳
2 脉冲场凝胶电泳
3
毛细管电泳
其他：如扩增不同 4 大小的片段比较
……
Clinica Chimica Acta 424 (2013) 274–286
不同实验室核酸提取后完整度比较 （脉冲场凝胶电泳）
5
个体化用药核酸检测
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临床病原微生物核酸提取
病毒与细菌 耐药相关检 测 细菌 核酸病检毒测
核酸检测
结核HT分BBV枝--DD杆NN菌AA、耐
药基H因CV检-R测NA
痰、肺及支气管灌洗液、 咽拭子等 血血清清或、血血浆浆、乳汁等
性病类：NG-DNA、 生殖泌尿道分泌物、眼
耐CT甲-D氧NE西AB、林-DU金NU黄-AD色NA
1. 检测260nm、280nm、
（ 320nm ）OD值，计算纯度
2. 层析
层析
NATURE PROTOCOLS, 2007,2(12)
重庆市临床检验中心
RNA核酸提取评价
完整性(Integrity)
评价方法
RNA电泳图：
1 普通凝胶电泳
毛细管电泳/RIN 2 值等
理想的RNA完整性为：清晰的 28S/18S两条带，以及5S条带，无 基因组污染的DNA条带。28S/18S 应近似两倍。
重庆市临床检验中心
引言
核酸提取质量管理
性能验证
试剂性能验证记录应能反映该批试剂的核酸提取效率 和核酸扩增效率。
可采用凝胶电泳试验比较核酸提取物与核酸标准物确 认核酸片段提取的完整性、260nm紫外波长测定确认核酸提 取的产率、260nm/280nm比值 确认核酸提取的纯度。
检验过程
应使用验证过的核酸抽提和纯化方法。
检测
用药个体化 核酸检测
肿瘤基因 检测
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引言
核酸
脱氧核糖核酸
(deoxyribonucleic acid, DNA)
核酸的紫外吸收
核糖核酸
(ribonucleic acid, RNA)
• 线性高分子化合物，粘度极大； • 多元酸，较强酸性； • 核酸分子具有强烈的紫外吸收。
DNA纯品A260/A280=1.8 RNA纯品A260/A280=2.0
二、将影响后续实验的物 质加入到标本中，看提取试 剂是否能够有效去除干扰。
交叉污染
将已知不同浓度的病原 体含量（包括阴性）的标本 用待评价试剂提取，比较所 得到的结果。可知纯化后是 否存在标本间交叉污染。
重庆市临床检验中心
核酸提取其它评价
成本、时间、特殊设备要求等
Journal of Microbiological Methods 76 (2009) 30–37.
重庆市临床检验中心
DNA核酸提取评价
完整性(Integrity)
不同的提取方法 对核酸提取完整性的影响（ ImageJ分析）
Clin Chim Acta. 2015 Feb 2;440:205-10.
样本提取间隔时间 对完整性的影响(脉冲场电泳)
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RNA核酸提取评价
产率 (yield)
重庆市临床检验中心
引言 多样化
临床核酸提取标本类型
血液：全血、血清、血浆、血斑… 粪便、尿液、脑脊液…
分泌物：痰、乳汁、拭子…
细胞：肿瘤细胞、羊水细胞… 病理组织、微生物菌落…
重庆市临床检验中心
引言
核酸提取方法
病毒核酸 提取方法
基因组核酸 提取方法
RNA 提取方法
有机提取法 靶向捕获技术 硅材质技术 …
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微量样本的核酸质量评价
如微生物群体中pg级的DNA提取量
• 使用荧光双链DNA染料
法在quabit荧光计上测
定浓度。
• Lonza FlashGel system检 测完整性、16S rRNA基 因进行qPCR检测
Nat Protoc. 2015 May;10(5):768-79.
我室核酸纯化过程中乙醇未完全去 除导致测序结果出现杂峰
乙醇未完全去除标本
乙醇完全去除标本