病毒-ssRNA或+ssRNA的提供： 提取病毒基因组 反转录得到cDNA 插入 合适的载体 转入细胞，在外源提供RNA 聚合酶的情况下转录出全长的-ssRNA或 +ssRNA。 病毒三种蛋白的提供： 提取病毒基因组 分别克隆相应的基因 插入合适的载体 转入细胞，表达出相应 的蛋白。
-ssRNA or +ssRNA？
Stop-start model
一个基因转录的终止是下一个基因转录起 始必须的。 RNA聚合酶在终止上一个基因转录时，大约 有30%的RNA聚合酶不能起始下游基因的转 录，造成转录依次递减30%。 研究发现，-ssRNA基因表达的调控主要是通 过基因与3’端启动子的位置来控制的。
RV基因组的复制
RV基因的转录
转录重要的顺式作用元件：启动子、转录起 始位点和转录终止信号。 RV基因转录调控模式：stop-start model。
RV转录元件
RV基因组仅有一个启动子，5个基因有相同的转录起始位 点：UUGU和转录终止信号：A/UCUUUUUUU。 通用模式：-间隔区UUGU---ORF---A/UCUUUUUUU间隔区。
狂犬病病毒分子生物学基础
狂犬病（Rabies）
俗称“疯狗病”，是由狂犬病病毒引起的 一种接触性传染病，呈世界性流行，死亡 率几乎为100%。 每年造成超过55,000人死亡，其中99%在亚 洲，印度具首位，中国第二位。 临床特征是前期神经兴奋，后期意识障碍 ，局部和全身麻痹而死。 因采取疫苗接种及综合防治措施，目前已 有日、韩、马来、澳等36个国家消灭了狂 犬病。
Gregor Johann Mendel 1822 -1884
1
：
1
反向遗传学技术
基因型（genotype） 表型（phenotype）
基因重组技术
-ssRNA反向遗传学建立的基础
L、P、N和病毒-ssRNA或+ssRNA包装形成核糖核蛋 白复合体( ribonucleoprotein, RNP)。 RNP负责病毒进入细胞后的所有复制过程，包括病 毒基因的转录和基因组的复制等。 体外构建具有活性的病毒单位必须提供：1.病毒ssRNA或+ssRNA；2.L、P和N三种蛋白。
狂犬病病毒属的分类
根据 N基因 5’端 500 bp碱基的同源性分析，可以将狂 犬病病毒属分为7种基因型（Genotype，GT）：
GT I II III IV V 病毒名称 狂犬病病毒 Lagos蝙蝠株 Mokola病毒 Duvenhage病毒 欧洲蝙蝠病毒-1 缩写 RV LagV MokV DuvV EBL-1
RV ss (-) RNA genome
3’
RT 5’
5’ 3’
genome (-)
antigenome (+)
PCR
5’ 3’ 3’ 5’
dsDNA
转录
5’
3’ 5’
3’ 5’
3’ 5’
3’ 5’
3’
mRNA
蛋白翻译
RV G蛋白主要抗原位点
II 34-42 I IV III
膜内区：462-505 aa
198-200 231 264 244-281 G5
330-357
342-343 a
膜
膜外区：1-439 aa 跨膜区：440-460 aa
反向遗传学技术
经典遗传学技术
表型（phenotype） 基因型（genotype）
病原
狂犬病病毒：Rabies virus, RV。 有两种主要抗原：一种是外膜上的糖蛋白 抗原，为主要抗原，决定病毒的嗜神经性 、致病性和产生中和抗体；内层的核蛋白 抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀 素，无保护作用。 从患者或患病动物体内分离的毒株成为自 然毒株或街毒株（street virus），毒力 强；经过脑组织多次传代后，成为固定毒 株（fixed virus），毒力弱，可以用于疫 苗制备。
G 蛋白简介
狂犬病病毒G蛋白参与病毒的组织趋向性和致病性，是主 要的保护性抗原，负责诱导病毒中和抗体的产生。 整个G蛋白分为四个结构域：信号肽(signal peptite, SP)膜外区(ectodomain, ECTO)，跨膜区(transmembrane region, TM)和膜内区 (endodomain, ENDO)，成熟的G蛋 白包括后面三个结构域。 G 全长: 522-533 aa 成熟G蛋白: 503-514 aa SP: 19 aa, TM: 22 aa, ECTO: 439 aa, ENDO: 42-53 aa
VI
VII
欧洲蝙蝠病毒-2
澳大利亚蝙蝠病毒
EBL-2
ABL
……….
两个遗传谱系
疫苗的 交叉保护 作用仅存 在与同一 个遗传谱 系内的病 毒中！
病毒感染的一般步骤
吸附 进入 脱壳 病毒基因转录和复制 子代病毒装配 释放
RV感染的一般步骤
RV的复制和转录
RV基因转录vs复制
3’leader和 5’trailer互补链均含有复制起始信号，但 5’的 trailer互补链的复制信号强度大于3’ leader，造成-ssRNA： +ssRNA=50:1 ， 因 此 包 装 成 熟 的 病 毒 粒 子 含 有 -ssRNA 与 含 有 +ssRNA的比例也约为50:1
VSV转录和复制模型
58种植物病毒未归类 
狂犬病病毒：Rabies virus, RV
75 nm (60～85 nm)
180 nm (60～400 nm)
RV基因组构成
大小：约12 kbp。 单股负链RNA (-ssRNA)。 基因排布（3’to 5’）：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质 蛋白（M）、糖蛋白（G）和大蛋白（即依赖RNA的RNA聚合酶， L）。其中N基因最保守，常用于进化分析；G基因编码的G蛋白 是病毒唯一暴露在外表面的蛋白，是病毒的主要抗原，同时也 是引起宿主免疫应答的主要组分。
两种状态的RNA聚合酶：RNA转录酶和RNA复制 酶。 RNA转录酶：L、P、EF-1αβγ、Hsp60、GT（ 鸟苷转移酶），从N基因处直接开始转录。 RNA复制酶：L、P、可溶性的N蛋白（N-P复合 物形式存在，为复制必须），从基因组的第一 个bp处开始合成leader RNA和复制基因组。
逆轴突运输机制
(Cited from Dietzschold et al., 2005)
小结
狂犬病病毒RV是弹状病毒科(Rhabdoviridae )狂犬病 病毒属 (Lyssavirus )的模式病毒种。 RV 呈子弹状，长约为 180 nm (60-400 nm) ，直径约 为75 nm (60-85 nm) 。 具有囊膜包被，基因组为12 kbp大小的单股负链 RNA (-ssRNA)。 高度嗜神经性，且逆轴突传播。 含有5个结构基因，从3’到5’依次为N、P、M、G和L。 病 毒 粒 子 大 小 ： 5×105—8×105 kDa ， 沉 降 系 数 为 600S。
病原学
病毒主要存在于中枢神经系统、唾液腺和唾液 内。在唾液腺、海马角、大脑皮层细胞浆内形 成嗜酸性包涵体，称为Negri bodies (NB)， 是病毒复制和装配的场所。 病毒可以在大鼠、小鼠、家兔和鸡胚等脑组织 内增殖、致弱，也可以通过驯化，适应于非脑 组织细胞。
狂犬病疫苗
疫苗：所有用减毒或者杀死的病原生物（包 括细菌、病毒、立克次氏体等）或其抗原性 物质所制成，用于预防接种的生物制品。 目的：预防、控制疾病（如狂犬病）的发生 、流行。 1881年法国巴斯德最早应用连续传代减弱病 毒毒力，成功制造出狂犬病疫苗。 目前接种狂犬病疫苗是预防狂犬病唯一有效 的手段。由于狂犬病几乎100%的致死性，人 用狂犬病疫苗必须是灭活苗。
-ssRNA vs +ssRNA
定义：一般来说根据RNA能否直接起mRNA作 用而分成单股正链RNA病毒(正股RNA病毒) 与单股负链RNA病毒(负股RNA病毒)两种。 RV属于单股负链RNA病毒，即-ssRNA病毒。
RV感染周期
(Cited from Dietzschold etห้องสมุดไป่ตู้al., 2005)
病毒的形态
⑴球状病毒；⑵杆状病毒；⑶砖形病毒； ⑷冠状病毒；⑸丝状病毒；⑹链状病毒； ⑺有包膜的球状病毒；⑻具有球状头部的 病毒；⑼封于包含体内的昆虫病毒等。 病毒粒的对称体制： 病毒粒的对称体制只有两种，即⑴螺旋对 称（代表烟草花叶病毒） ⑵二十面体对称 （等轴对称，代表腺病毒）。一些结构较 复杂的病毒，实质上是上述两种对称相结 合的结果，故称作复合对称（代表T偶数噬 菌体）。
病毒的分类
国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses：ICTV）
弹状病毒科病毒结构示意图
弹状病毒科成员
水泡性病毒属
VSV
弹状病毒科
狂犬病病毒属 RV 短暂热病毒属  非毒粒弹状病毒属  细胞核弹状病毒属  植物病毒 细胞质弹状病毒属 
病毒粒子的装配
研究发现，RV的基因组两端不存在特定的包装 信号，-ssRNA或+ssRNA包装入病毒粒子完全由 两种RNA在细胞内的丰度决定(Finker et al., 1997)。 然而，对VSV的研究发现，VSV基因组-ssRNA 5’端的trailer区含有包装信号，使-ssRNA被 选择性包装入核衣壳 (Whelan and Wertz , 1999)。
杆状病毒
HIV
丝状病毒
腺病毒
病毒的分类
从遗传物质分类：DNA病毒、RNA病毒、蛋 白质病毒（如：朊病毒）。 从病毒结构分类：真病毒（Euvirus，简称 病毒）和亚病毒（Subvirus，包括类病毒 、拟病毒、朊病毒）。 从寄主类型分类：噬菌体（细菌病毒）、 植物病毒（如烟草花叶病毒）、动物病毒 （如禽流感病毒、天花病毒、HⅣ等）。 从性质来分：温和病毒（HⅣ）、烈性病毒 （狂犬病病毒）。