多波长高效液相色谱法同时测定栀子中的三类成分徐 燕,曹 进,王义明,罗国安3(清华大学药物研究所,北京100084)摘要:目的 同时测定栀子中3类有效组分,9个成分(栀子酸、栀子苷、异栀子苷、京尼平龙胆二糖苷、绿原酸、藏红花酸、3种藏红花素)的含量。
方法 紫外2可见三波长同时检测的高效液相色谱法:色谱柱为Phenomenex LunaC 18柱(250mm ×416mm ID ,5μm );流动相为(A )013%甲酸水溶液,(B )甲醇2乙腈(9∶1);流速为018m L ・min -1;柱温为35℃;检测波长为240nm (栀子酸、栀子苷、异栀子苷、京尼平龙胆二糖苷),330nm (绿原酸)和440nm (藏红花酸和3种藏红花素);线性梯度洗脱。
结果 建立了同时对栀子中的9个成分进行定量的测定方法,并将此方法用于5个产地栀子各成分的测定。
结论 为中药材栀子提供了更合理、可靠的质控方法。
关键词:高效液相色谱法;栀子;环烯醚萜苷;绿原酸;藏红花素;藏红花酸中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0513-4870(2003)07-0543-04Simultaneous determination of 3kinds of components in Gardenia by high 2perform ance liquid chrom atography u nder di fferent UV 2vis w ave lengthX U Y an ,CAO Jin ,WANG Y i 2ming ,LUO G uo 2an3(Institute o f Medicine ,Tsinghua Univer sity ,Beijing 100084,China )Abstract :Aim T o determine 3kinds of biologically active com ponents (9com pounds )in Gardenia ,namely geniposidic acid ,gentiobioside ,gardenoside ,genipin geniposide ,chlorogenic acid ,crocin 1,crocin 2,crocin 3and crocetin simultaneously and quantitively.Methods An HP LC method detected by 3different UV 2vis waves —240nm for geniposidic acid ,geniposide ,gardenoside ,genipin gentiobioside ,330nm for chlorogenic acid ,440nm for crocin 1,crocin 2,crocin 3and crocetin respectively ,has been developed :Phenomenex Luna C 18column (250mm ×416mm I D ,5μm )with linear gradient elution using methanol 2acetotrile (9∶1)and 013%aqueous formic acid.R esults This method success fully determined 9com pounds in Gardenia (from 5different areas )simultaneously and quantitively.Conclusion This is a m ore reas onable and credible quality control method for the Chinese traditional medicine.K ey w ords :HP LC ;Gardenia jaminoides ;iridoid ;chlorogenic acid ;crocetin ;crocin收稿日期:2002210215.基金项目:国家973重点基础研究项目“中药方剂关键科学问题基础研究”资助项目(G 1999054404).3通讯作者 T el ΠFax :86-10-62781688,E 2mail :luoga @chem. 栀子为茜草科植物栀子(Gardenia jaminoides )的干燥成熟果实,具有清热利尿和凉血解毒的功效[1]。
化学成分研究表明,栀子含有3类主要有效成分(结构见图1):环烯醚萜苷,有机酸和色素(主要为藏红花素)[1]。
运用高效液相色谱法(HP LC )研究栀子化学成分的文献已有不少,但绝大部分只对其中的栀子苷进行定量测定,小部分对多种环烯醚萜苷类物质进行了定量分析[2～6],至今未见运用HP LC 法对其中3类成分进行同时测定的文献报道。
现代药理实验表明,仅将栀子苷作为栀子的质控指标是不够的,很有必要将其中有机酸、色素类物质的测定纳入到质控标准中[1,7,8]。
中药材属于复杂体系,单味药中就含有在常规色谱条件下难以同时分离、定量的多类成分。
本文提出的在HP LC 2DAD 上实现的多波长高效液相色谱法,根据栀子中3类成分不同的光谱・345・药学学报Acta Pharmaceutica S inica 2003,38(7):543-546特性,建立了在3个紫外2可见(UV2Vis)检测波长下,同时测定其中3类组分(9个成分),并将方法运用于5个产地栀子中各成分的测定。
多波长高效液相色谱法为中药材中多类组分的同时测定提供了新的模式,也提供了更加合理、可靠的质控依据。
Figure1 Structures of the major constituents of Gasdenia jaminoides材料与方法仪器和试剂 Agilent1100型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器),SZ293自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂),离心机(LD522A型,北京医用离心机厂)。
栀子果实(购于安国市,分别产于:江西、广西、浙江、湖南、海南)和藏红花(购于北京市同仁堂药店)药材,由西南交通大学药学系张兴国副教授鉴定。
乙腈、甲醇(Fisher公司,色谱纯),甲酸(分析纯),二次蒸馏水(自制)。
标准品:栀子苷(geniposide)、异栀子苷(gardenoside)、栀子酸(geniposidic acid)、京尼平龙胆二糖苷(genipin gentiobioside)购于Y oneyama公司(日本),绿原酸(chlorogenic acid)、藏红花酸(crocetin)购于Sigma公司,藏红花素1(crocin1)、藏红花素2(crocin2)、藏红花素3(crocin3)由本实验室从藏红花中得到,并经波谱分析确定其结构。
供试品溶液的制备 精密称取粉碎后的栀子果实011g,加入甲醇25m L,超声处理20min,放冷,过滤,滤液离心10min,取上清液备用。
对照品溶液的制备 精密称取各对照品,分别溶于甲醇,配制5个浓度水平对照品溶液:01002,01004,01006,01008和01010g・L-1的栀子酸对照溶液;01002,01004,01006,01008和01010g・L-1的异栀子苷对照溶液;01005,01010,01015,01020和01025g・L-1的京尼平龙胆二糖苷对照溶液;0105,0110,0115,0120和0125g・L-1的栀子苷对照溶液;01001,01002,01003,01004和01005g・L-1的绿原酸对照溶液;01001,01002,01003,01004和01005g・L-1・445・药学学报Acta Pharmaceutica S inica2003,38(7):543-546的藏红花素1对照溶液;01001,01002,01003,01004和01005g・L-1的藏红花素2对照溶液;010005, 010010,010015,010020和010025g・L-1的藏红花素3对照溶液;010002,010004,010006,010008和010010g・L-1的藏红花酸对照溶液。
色谱条件 色谱柱:Phenomenex Luna C18色谱柱(250mm×416mm I D,5μm);流动相:A为013%甲酸水溶液,B为甲醇2乙腈(9∶1);流速:018 m L・min-1;柱温:35℃;检测波长:240,330和440 nm;进样量:20μL。
线性梯度洗脱时间程序如下:开始时10%B;15min时40%B,保持3min;35min时100%B,保持5min;45min时10%B。
结果与讨论1 流动相的选择实验过程中尝试了甲醇2水、乙腈2水、甲醇和乙腈(改变两者比例)2水等体系,并尝试在流动相中添加甲酸或四氢呋喃,以调节pH值或极性,分别试验了等度和梯度洗脱的方式。
试验发现,乙腈比例增加,可以显著缩短保留时间,但分离度有所降低;加入甲酸使体系呈弱酸性能够改善峰形及分离度。
经过条件优化,最终确定了如前所述的色谱条件。
2 检测波长的选择DAD检测器在200～600nm全波长扫描,结果表明:环烯醚萜苷类在239nm处有最大吸收;绿原酸在220,246和329nm有3个吸收峰,其中246nm 处最弱,329nm处最强;藏红花素类在250～260nm, 320～340nm和400～500nm有3个吸收峰,其中250～260nm处吸收最弱,(cis2)藏红花素类在320～340nm处吸收最强,但在藏红花和栀子中含量很低,藏红花和栀子中含量较高的藏红花酸、藏红花素1,2和3属于(trans2)藏红花素类,在400～500nm 处有强吸收[9,10]。
为了使各组分达到吸收强、干扰小的目的,选择在240nm测定环烯醚萜苷类物质, 330nm测定绿原酸(绿原酸在246nm有吸收,故240 nm的色谱图上亦有绿原酸的峰,但吸收弱而不适于定量),440nm测定藏红花素类物质。
3 色谱分离在优化后的色谱条件下,进行了3个波长(240, 330和440nm)下测定栀子3类成分的HP LC色谱法,可看出,各成分均得到了很好的分离,保留时间见表1。
4 标准曲线和检测限在优化的色谱条件下,各成分分别在5个浓度点,平行测定3次,用峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归,结果表明各成分在各自浓度范围内线性关系良好。
回归方程、线性范围、相关系数及检出限结果(SΠN=2)见表1。
T able1 R egression equation and detection limitC om pound Retention timeΠm in Regression equation C orrelation coefficient Linear rangeΠmg1L-1Detection lim itΠmg・L-1 G eniposidic acid1011Y=36718X+1212019994015-10001356G ardenoside1211Y=40712X+1419019993110-20001552G enipin gentiobioside1514Y=27414X+918019990110-50001503G eniposide1719Y=9918X+413019995110-100001446 Chlorogenic acid1319Y=46411X+1214019993015-5001201 Crocin12711Y=40913X+1210019992110-10001523 Crocin22818Y=44613X+1712019993110-10001425 Crocin33218Y=39719X+1412019991015-5001352 Crocetin3515Y=41213X+1311019992015-50012315 方法的重复性、稳定性和回收率考察平行配制5份供试品溶液,在优化的色谱条件下测定,以峰面积值为指标计算RS D(n=5),考察方法的重复性。