栀子双波长融合高效液相色谱数字化指纹图谱研究（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的采用双波长融合法建立栀子254 nm和326 nm波长下的融合HPLC指纹图谱。
方法采用反相高效液相色谱法，使用CenturySIL C18 BDS柱(20 cm×4.6mm，5μm)，以1%醋酸水-1%醋酸乙腈为流动相，低压线性梯度洗脱，柱温（30.0±0.15）℃，采用DAD检测器同时采集2个特征吸收波长下的信号，测定10批不同产地栀子HPLC指纹图谱。
结果用“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统”软件建立了栀子254 nm和326 nm的双波长融合HPLC指纹图谱，以栀子苷为参照物，确定了41个共有峰，并对其进行了全面评价。
结论所建立的双波长融合谱能有效控制栀子的质量，克服了单波长检测时信息量有限的缺点，能较全面、真实地揭示中药材的内在质量特征。
【关键词】栀子；高效液相色谱数字化指纹图谱；双波长融合；超信息特征Abstract：ObjectiveTo explore the HPLC-FPS of water extractof Fructus Gardeniae by dual-wavelength fusing method. MethodsThe chromatographic fingerprints were obtained by injecting the sample solution each time on a CenturySIL C18 BDS column (20 cm×4.6 mm，5 μm) with the gradient elution solvent system composed of 1% acetate acid -water and 1% acetate acid -acetonitrile. The flow rate was 1.0ml/min, the column temperature was maintained at (30.00±0.15)℃and the DAD detector was used. ResultsThe HPLC-FPS of water extract of Fructus Gardeniae was established with dual-wavelength fusing method, acquired 41 common peaks by taking the peak of geniposide as referential peak. The fingerprints were comprehensively evaluated by “The digitized evaluation system of the Traditional Chinese Medicine fingerprint with the super-information characteristics”and the results were analyzed and compared with that of the fingerprints obtained under 265 nm. ConclusionThe dual-wavelength fusing method can effectively control the quality of Fructus Gardeniae and overcome the low information of mono-wavelength detection. It offers guarantee for the quality control of Fructus Gardeniae and provides a new method for thoroughly and authentically revealing the characteristics of TCM.Key words：Fructus Gardeniae; Dual-wavelength fusing method; High performance liquid chromatography;Fingerprints;Super-information characteristic栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，其味苦、寒，归心、肺、三焦经，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒之功效。
其主要化学成分有环烯醚萜苷类(如栀子苷)、有机酸类(如绿原酸)、色素(如藏红花素)，此外还有挥发性成分及多糖等［1］。
文献中有对栀子进行指纹图谱研究的报道［2～4］，但由于栀子中环烯醚萜苷类、有机酸酯类、西红花苷类等成分的最大吸收波长不一致，建立单一波长下的HPLC指纹图谱难以对栀子进行整体表达和全面评价。
曾有人应用融合方法对指纹图谱进行研究，但未能全面反映其信息［5～6］。
本文运用二极管阵列检测器采集了2个特征吸收波长下的指纹图谱，用“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统”软件［7］建立了栀子水提取液254 nm和326 nm的双波长融合HPLC指纹图谱，并对其进行了全面评价，将其与265 nm 波长下指纹图谱进行对比，证明双波长融合指纹图谱优于单波长指纹图谱，符合建立中药指纹图谱的信息最大化原则。
1 仪器和试药Agilent 1100 型液相色谱仪（配有二极管阵列检测器、低压四元梯度泵、在线脱气装置、自动进样器），Chem Station工作站（Agilent科技有限公司）。
KQ-50B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），旋转蒸发仪RE52（上海亚荣生化仪器厂），Sarturius-BS110S 分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）。
绿原酸、栀子苷（中国药品生物制品检定所），乙腈（色谱纯，山东禹王实业有限公司），冰醋酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心），其它试剂均为分析纯，所用水为去离子水。
10批栀子药材产自河南唐河县S1，贵州铜仁S2，安徽池州东至县S3，河南桐柏县S4，云南威信县S5，云南省红河哈尼族彝族自治州S6，浙江五凤乡S7，四川达县S8，江西金溪县S9，广西鹿寨县S10，经沈阳药科大学孙启时教授鉴定均为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。
2 方法与结果2.1 样品供试液制备栀子于60℃干燥40 min，粉碎后取约2.5 g，精密称定，加水50 ml，回流提取2 h，滤过，残渣加水30 ml，继续回流2 h，合并两次滤液，减压浓缩至20 ml，加乙醇至80%(V/V)，冷处避光放置、醇沉24 h，滤除沉淀，减压回收乙醇至无醇味，残液再用水定容至25 ml，摇匀，作供试液。
2.2 对照品溶液制备精密称取栀子苷对照品5.0 mg，置25 ml 量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为200 μg·ml-1栀子苷对照品溶液。
同法配制400μg·ml-1绿原酸对照品溶液。
2.3 色谱条件Century SIL C18 BDS柱(20 cm×4.6 mm，5 μm)，流动相：A=水（含1%醋酸），B=乙腈（含1%醋酸），低压线性梯度程序：0～9 min，5%～5%B；9～22 min，5%～10%B；22～30 min，10%～12.5%B；30～45 min，12.5%～30%B；45～50 min，30%～36%B；50～75 min，36%～86%B；流速1.0 ml·min-1，柱温（30±0.15）℃，进样量5 μl。
2.4 双波长融合指纹图谱的获得将栀子供试液进样5 μl，同时采集多个波长下的信号并记录3D光谱图，结果在280 nm和350 nm 波长下的色谱图中色谱峰较少且信号很弱；265 nm波长下色谱峰较多且基线较平；254 nm波长下0～30 min色谱峰较多且信号强，但基线不够理想；326 nm波长下30～60 min色谱峰较多且信号强，但0～30 min色谱峰很少。
为使指纹图谱中信息达到最大化，用“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统”软件将254 nm（0～30 min）和326 nm（30～60 min）下的图谱进行融合处理，即得到栀子双波长融合HPLC指纹图谱。
2.5 指纹图谱方法学考察2.5.1 系统适用性实验将栀子苷对照品溶液和样品供试液分别进样5 μl，对比保留时间及在线紫外光谱图可知栀子苷峰在23.6 min 左右。
由于栀子苷峰与相邻峰分离很好，在测定时比较稳定，峰面积较大，因此选作参照物峰。
在此系统条件下，以栀子苷计算色谱柱的理论板数应不低于160 000。
2.5.2 精密度实验精密吸取S1号栀子样品供试液5 μl，连续进样5次，记录色谱图，经处理得双波长融合HPLC指纹图谱。
以栀子苷峰为参照物峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
结果显示，样品供试液分析结果稳定，各共有峰相对保留时间RSD均小于1.0%；相对峰面积的RSD其余均小于4.0%，表明检测系统的进样精密度良好。
2.5.3 溶液稳定性实验取S1号栀子样品，按“2.1”项制备供试液，分别在制备样品后的0，4，8，12和16 h进样测定，记录色谱图，经处理得双波长融合指纹图谱。
以栀子苷峰为参照物峰，计算各峰的相对保留时间的RSD均小于1.0%；相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明样品在16 h内基本稳定。
2.5.4 方法重复性实验取S1号栀子样品，按“2.1”项制备供试液5份，精密吸取5 μl在HPLC仪上进样并检测，记录色谱图，经处理得双波长融合指纹图谱。
计算各峰的相对保留时间的RSD均小于1.0%；相对峰面积的RSD均小于4.0%，表明方法重复性良好。
2.6 栀子双波长融合HPLC指纹图谱建立2.6.1 共有指纹峰的标定对10个不同产地的栀子进行指纹图谱检测，记录其色谱图，经处理得双波长融合指纹图谱。
比较分析并以共有率100%计，确定共有峰为41个，见图1。
10批供试品HPLC 图谱各共有峰相对保留时间的RSD除2号峰（RSD = 4.84%），其余均小于3.0%，栀子苷峰（18号）与相邻峰分离较好，响应值较大，因此选作参照物峰。
参照峰标号为18（S），其他共有峰依次为1，2，3， (41)2.6.2 对照指纹图谱的建立及相似度评价将10批栀子色谱图原始信号导入孙国祥等［7］开发的“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统”软件生成对照指纹图谱（平均值法）数据见表1，标号图见图2。