，是构建一个高效表达载体首先要考虑的问题。
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3、转录的有效延伸和终止 外源基因的转录一旦被起始，接下来的问题是如何
保证mRNA有效地延伸、终止。 转录衰减和非特异性终止可诱发转录提前终止。
措施： （1）除去衰减子 （2）插入抗转录终止序列 （3）强转录终止序列
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4、有效的翻译起始（关键因素） 原核：SD序列，能帮助从起始AUG处开始翻译。 真核：kozak（科扎克）序列，核糖体能够识别
热诱导
T7 RNA 聚合酶
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
cI857
双质粒系统
一 个 质 粒 带 有 T7 RNA 聚合酶基因，另一个质粒带 有 T7 启动子和目的基因
两个质粒的复制子和抗 性标记不能相同，调控方式 为控制 T7 RNA 聚合酶的启 动子调控类型
ColE1 ori
AmpR
T7 启动子
完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。
融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编 码区的串联体，但构成一个整体的单一ORF， 如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如 果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个 多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可 以偶连两个或多个相关基因的表达。
将2价重金属阳离子固定在树脂上，便可 对带His标签的融合蛋白进行亲和层析分离。纯化 的融合蛋白再用Xa因子处理可去除标签多肽，从 而获得纯化的目的蛋白。
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3、内含肽表达载体(即蛋白质内含子,是存在于前 体蛋白质中的一段氨基酸序列) ： 如 NEB 公 司 的 Impact-Twin系统，将目的蛋白放在两个可自裂 解的内含肽(intein)中间，在得到融合蛋白以后 不通过蛋白酶消解、只需要调节pH值等条件就将 标签蛋白切除。
pGEX-1T—凝血酶 pGEX-2T---凝血酶 pGEX-3T---X因子
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2、组氨酸标签表达载体：如Novagen公司的pET系 列，可在目标蛋白的N-端或C-端加上6个组氨酸的 标签和Xa因子酶切位点，多聚组氨酸能与镍等二 价金属离子结合，纯化目的蛋白，用Xa因子处理 可得到纯的目的蛋白。
T7 RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠 杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被 大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。
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T7 表达系统转录调控的机理
T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。
化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统
阻抑转录，高温(40-45℃)下解除抑制。 T7噬菌体启动子：较复杂
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二、利用T7噬菌体启动子的表达载体
大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强 的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建 的表达系统称为 T7 表达系统。
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T7 表达系统
T7噬菌体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活 T7噬菌体启动子的转录。
表达载体构建的一般原则
1、阅读框架 要使目的基因得以表达，最重要的因素是外源目的
基因本身必须置于正确的阅读框架之中。 用人工接头可以调节阅读框架，选择适当的人工接
头，就可使外源基因处于正确的阅读框架中。
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2、启动子（关键因素） 有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞
中高效表达的关键步骤之一。 因此，选择强的启动子及其相关的调控序列
固定在琼脂糖树脂上
谷胱甘肽
形成亲和层析柱
表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱
融合蛋白吸附在树脂上
其他细胞蛋白被洗脱出来
用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱
融合蛋白被释放出来
用凝血蛋白酶切割融合蛋白
获得纯化的目的蛋白
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融合型载体----pGEX系列
位相载体 Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物，切割方便：
可溶性的表达产物一般可展现应有的蛋白质活性 。
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不同微生物种类所产生的活性物质类型有明显差 异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。
如70%的抗生素来源于放线菌，如以寻找抗菌抗肿 瘤活性物质为目标，选择链霉菌为宿主较理想， 而筛选新的酶则采用大肠杆菌为宜。
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四、 表达产物的纯化
1、包涵体蛋白的纯化
通过机械法、超声波处理等方法破碎外源蛋白的细胞 → 离心 → 获得包涵体 → 洗涤 → 去除包涵体结 合的细胞蛋白→ 利用盐酸胍、尿素和SDS等溶解包涵 体 → 蛋白质重新折叠
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2、可溶性蛋白的纯化
融合蛋白的表达标签可用于分离纯化目的蛋白
分泌ห้องสมุดไป่ตู้达载体也有助于分离纯化可溶性的表达产 物。
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3、表达的控制
诱导表达系统：IPTG 防渗漏表达系统：lacIq，一种能产生过量的 LacI 阻
遏蛋白（阻遏转录过程）的 lacI 基因的突变体。 PL启动子受cⅠ基因（阻遏溶菌周期基因表达）产物
的抑制，在λ噬菌体溶原的大肠杆菌中表达。 cⅠ基因的温度敏感突变体cI857（ts）：低温(30℃)下
E.Coli （DE3）
T7 启动子
目的基因
IPTG 诱导
T7 RNA 聚合酶
lac 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
温度诱导型
PL 启动子控制T7 RNA 聚
合酶基因，通过热诱导方式激 发T7 噬菌体启动子的转录。
E.Coli （CE6）
T7 启动子
目的基因
这种方式可以使本底转录 降到很低的水平，尤其适用于 表达对大肠杆菌宿主有毒性的 重组蛋白质。
选择性降解
（2）构建成可分泌的蛋白：不是所有的外源蛋白都可 以通过基因操作成为可分泌蛋白。
（3）使外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达
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总之，构建表达载体应根据表达体系的特性，选 择性地应用上述原则，删除降低外源基因表达的 一些元件，插入提高外源基因表达的一些必需元 件。
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第一节 大肠杆菌表达载体
mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。
5、翻译终止密码选择 在原核生物中，翻译的终止由两个释放因子所控
制，RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA。 由于UAA为两个释放因子所识别，因此在基因工程 中，一般采用UAA作为终止码。
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6、外源蛋白的稳定性
可采取以下措施避免克隆的蛋白被选择性降解： （1）构建融合基因，产生融合蛋白，使外源蛋白不被
trc，都受IPTG诱导。 T7噬菌体启动子 λ噬菌体的PL启动子。
2）终止子：依赖于ρ 因子或不依赖于ρ 因子（遇茎环 结构而终止）。
3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)： 是mRNA上的特异性序列，核糖体可以识别并结合这 一序列来启动翻译过程。
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2、表达形式
4、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙， 可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠， 或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。
信号肽(signal peptide)有碱性磷酸酶信号肽、蛋 白质A信号肽（如Amersham公司的pEZZ18系统）。
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分泌型融合表达载体----pEZZ18
Plac：Lac启动子 Pspa：金黄色葡萄球菌蛋白A启动 子 S：蛋白A的信号肽序列 两个合成的Z功能域（结合免疫球 蛋白G，琼脂糖层析柱）
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架
基因克隆表达系统成熟完善
繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
被美国FDA(美国食品药物管理局)批准为安全的基因工
程受体生物
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大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
在表达系统中低水平表达 T7 溶菌酶基因，能与T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。通过共转化质粒 导入表达系统，它能明显降低本底转录。
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三、表达融合蛋白的表达载体
表达融合蛋白有下列优点： (1)转录和翻译起始从正常的E. coli序列开始，故 通常可以产生高水平的融合蛋白。 (2)融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定。 (3)产生的融合蛋白较大，因此很容易从蛋白质凝 胶电泳中区别出来。融合蛋白带可以从凝胶上切 下，经冷冻干燥，磨成粉末后即可作为抗原。 (4)有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外， 这有助于蛋白质的分离和纯化。
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一、大肠杆菌表达载体的结构
原核表达载体：适用于在原核细胞中表达 外源基因的载体。
均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的 基本要求，然后增加表达元件。
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1、表达元件(expression elements)
1）启动子(promoter)：三类，即 lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或
目的基因
热诱导
T7 RNA 聚合酶
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
cI857
p15A ori
KanR
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T7 表达系统存在的问题
T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达 系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底 转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会 影响细胞的生长。
解决办法
T7 启动子
目的基因
T7 RNA 聚合酶
？启动子 T7 RNA 聚合酶基因
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化学诱导型
噬菌体 DE3 是λ 噬菌体
的衍生株，一段含有 lacI启
动子和T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其中。
用 噬 菌 体 DE3 的 溶 源 菌 作 为表达载体的宿主菌，调控方 式为化学诱导型，类似于 Lac 表达系统。