过表达慢病毒载体构建和包装手册Version1.0吉凯基因二零一一年五月目录简介 (3)第一部分过表达慢病毒载体的制备实验流程 (4)实验材料 (5)过表达克隆制备 (6)第二部分慢病毒包装与滴度检测实验流程 (17)实验材料 (18)L e n t i v i r u s病毒包装 (21)病毒的收获及浓缩 (22)L e n t i v i r u s滴度测定 (24)参考文献 (33)简介慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。
吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。
慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。
吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。
GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。
通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。
pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。
pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。
吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。
本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。
同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
第一部分过表达慢病毒载体的制备一、流程图从含有目的基因的质粒中，利用PCR方法钓取目的基因，将目的载体进行酶切，酶切产物电泳回收后进行交换，其产物转化细菌感受态细胞。
对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR 鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功的目的质粒。
二、实验材料描述a)主要试剂试剂名称试剂来源cat.No. 1kp DNA ladder Marker Fermentas公司#SM0311 250bp DNA ladder Marker 捷瑞公司DL250+,100T 琼脂糖赛百盛公司GA4-100 限制性内切酶NEB公司R0136VIn-Fusion™ PCR Cloning Kit clontech 639626 Taq polymerase SinoBio E001-02B dNTP Takara D4030APrimer 捷瑞生物Plasmid 抽提Kit Promega A1460b)主要仪器仪器名称仪器来源cat. No.PCR仪Applied Biosystems公司2720 thermalcyclerpositive clone 测序美季生物技术ABI3730型稳压DNA电泳仪BioRad公司凝胶成像仪天能公司细菌摇床华利达实验设备公司HI-9211K 细菌培养箱上海一恒科学仪器有限公司Gilson移液器吉尔森公司高速离心机日立公司TGL-16G-A三、过表达克隆制备——以STK39基因为例描述详细实验过程1.基因信息：Symbol：STK39Accession：NM_013233Organism：HumanDescription：Homo sapiens serine threonine kinase 39 (STK39), mRNA. 2.工具载体:3.载体酶切：酶切反应温度：37℃酶切反应时间：2 h酶切反应体系：1.1.1 载体酶切结果：1.2 目的基因片段的获取 1.2.1 引物引物说明：含交换配对碱基、酶切位点（下划线标记的），表达增强序列（双下划线记的）以及目的基因5’端部分序列用于PCR 钓取目的基因1.2.2 PCR 扩增目的基因片段PCR 反应体系：PCR 反应条件：94℃ 5 min 94℃ 30 sec 55℃ 30 sec 72℃ 2 min 72℃ 10 min 4℃ ∞1.2.3 PCR 结果30 cycle1.3重组质粒构建模式图1.3.1PCR产物交换入线性化表达载体反应条件：25℃30分钟→42℃15分钟反应体系：反应体系(µL): 阳性对照自连对照实验组dd H2O 17.5-X-Y 17.5-X 17.5-X-Y10 ×In-Fusion交换酶缓冲液 2 2 2In-Fusion交换酶0.5 0.5 0.5线性化载体DNA X X X纯化后PCR产物片段Y 0 YTotal 20 20 20说明：a)加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的摩尔数比例为：1：3~1：9之间b)阳性对照加入的纯化的PCR产物为GAPDH基因（同样带有交换臂）1.3.2制备感受态细胞：配置下述溶液：1)0.1M CaCl2溶液，以0.22µm过滤除菌。
2)250mM KCl2溶液。
3)2M MgCl2溶液，高压灭菌。
4)SOB: 1ml 250mM KCl2溶液加入100ml LB，以5M NaOH 调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl2溶液。
用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞1)从于37o C培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100 ml LB培养基的1 L烧瓶中。
于37o C剧烈振摇培养3 小时(旋转摇床，300转／分)。
2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0o C。
3)于4 o C, 以4000转／分离心10分钟，回收细胞。
4)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。
5)以10 ml用冰预冷的0.1 mol／L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。
6)于4o C，以4000转／分离心10分钟，回收细胞。
7)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。
8)每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀。
9)将细胞分装成小份，放于-70o C冻存。
（感受态细胞制备参考：分子克隆实验指南第二版55页）1.3.3转化：1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 µL转移到无菌的微量离心管中，每管加10 µL 连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。
2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，不要摇动EP管架。
3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l—2分钟。
4)每管加800 µL LB培养基。
用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。
5)将150 µL已转化的感受态细胞转移到AMP抗性（100ug/ml）的LB琼脂培养基上。
6)将平板置于室温直至液体被吸收。
7)倒置平皿，于37℃培养，16小时。
8)长出的克隆进行后续PCR鉴定。
（转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页）1.4阳性克隆的PCR鉴定1.4.1引物引物说明：本对引物一个位于目的基因中，一个位于载体上，用于菌落PCR 鉴定转化子1.4.2 PCR 鉴定PCR 反应体系：PCR 反应条件： 94℃ 3 min94℃ 30 sec60℃ 30 sec72℃ 30 sec72℃ 5 min4℃ ∞1.4.3 PCR 结果30 cycle样品说明：接种阳性转化子，37℃培养16小时后保存为甘油菌，分装200µL送测序1.5阳性克隆测序结果及结果分析：>ref|NM_016866.2| Mus musculus serine/threonine kinase 39, STE20/SPS1 homolog (yeast)(Stk39), mRNAgb|BC064443.1| Mus musculus serine/threonine kinase 39, STE20/SPS1 homolog (yeast),mRNA (cDNA clone MGC:69607 IMAGE:6843981), completecdsLength=3268GENE ID: 53416 Stk39 | serine/threonine kinase 39, STE20/SPS1 homolog (yeast) [Mus musculus] (Over 10 PubMed links)Score = 3083 bits (1669), Expect = 0.0Identities = 1669/1669 (100%), Gaps = 0/1669 (0%)Strand=Plus/PlusQuery 84 CATGGCGGAGCCGAGCGGCTCGCCTGTGCACGTCCAGCTTTCCCAGCA ggcggccccggt 143 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 104 CATGGCGGAGCCGAGCGGCTCGCCTGTGCACGTCCAGCTTTCCCAGCAGGCGGCCCCGGT 163Query 144 gacagcggcggcggcgacggccccggcggccgcgacatcagcaccagccccggccccggc 203 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GATCCATAGGGATTTGAAAGCTGGAAATATTCTTCTGGGTGAGGATGGCTCAGTACAAAT 763Query 744 AGCAGATTTTGGAGTAAGCGCATTCTTAGCCACAGGGGGTGATGTTACACGGAATAAAGT 803 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 764 AGCAGATTTTGGAGTAAGCGCATTCTTAGCCACAGGGGGTGATGTTACACGGAATAAAGT 823Query 804 CAGAAAAACATTTGTTGGTACCCCATGTTGGATGGCCCCTGAAGTCATGGAACAGGTGAG 863 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 824 CAGAAAAACATTTGTTGGTACCCCATGTTGGATGGCCCCTGAAGTCATGGAACAGGTGAG 883Query 864 AGGCTATGACTTCAAGGCTGATATGTGGAGTTTTGGAATAACTGCCATTGAATTAGCAAC 923 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 884 AGGCTATGACTTCAAGGCTGATATGTGGAGTTTTGGAATAACTGCCATTGAATTAGCAAC 943Query 924 CGGAGCAGCGCCTTACCACAAATACCCTCCAATGAAAGTGCTAATGCTGACTTTGCAAAA 983 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct 944 CGGAGCAGCGCCTTACCACAAATACCCTCCAATGAAAGTGCTAATGCTGACTTTGCAAAA 1003Query 984 TGACCCGCCCACTTTAGAAACTGGTGTAGAGGATAAAGAAATGATGAAAAAATACGGCAA 1043 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