检测乙型脑炎病毒中和抗体的简化试验摘要：在亚洲，乙型脑炎病毒是病毒性脑炎的常见病因，据统计，每年大约有45000例病例。
它导致显着的发病率和死亡率。
乙型脑炎病毒主要通过库蚊在鸟类和动物之间传播，而人类被认为是其终末宿主。
由于登革热在乙型脑炎流行地区也很普遍，因此必须通过检测乙型脑炎病毒特异性中和抗体来证实乙型脑炎阳性血清。
噬斑减少中和试验是检测以及量化乙型脑炎病毒中和抗体的黄金标准。
然而，噬斑减少中和试验大约需要一个星期，并且在在6个或24孔板中进行，这对于大规模筛选具有局限性。
因此有必要开发一种可用于检测和定量乙型脑炎病毒中和抗体的简化方案。
该法在96孔板中进行，将适合用于大规模筛查人群的免疫水平以及疫苗的免疫效力研究。
关键词：乙型脑炎病毒；中和抗体；酶联免疫引言在亚洲，主要由节肢动物传播的乙型脑炎病毒是病毒性脑炎的常见病原。
据统计，每年大约有45000个病例，死亡率为25%;并且有高达50％的患者留有神经系统后遗症（世界卫生组织，1996年）。
乙型脑炎病毒为RNA正链病毒，属于黄病毒科。
病毒发生表现有地方性周期性特点，库蚊和猪为其主要的宿主，病毒在其体内大量复制。
然而，人类被认为是其终末宿主。
（Sabchareon和Yoksan，1998）在亚洲许多地方乙型脑炎病毒都有流行，往往在这些地方都伴随有登革热病毒流行。
因此，为了与登革热区分，就必须通过检测乙型脑炎病毒特异性中和抗体来证实其确为乙型脑炎病毒阳性血清。
此外，检测中和抗体也可作为检测乙型脑炎疫苗效力的合理的替代措施。
（Markofff L.，2000）。
“斑减少中和试验是检测和量化乙型脑炎病毒中和抗体的标准方法（Shyu等.1997）。
然而，斑减少中和试验需要一周才能完成并且仅在6或24孔板中进行，从而对于大规模的筛选表现出一定的局限性，在疫苗的效力学研究以及血清流行病学调查方面其局限性表现得更加突出。
结果通过肉眼计数斑块的数量来获得，而这，也有一定的主观偏差。
一种简便有效的检测和测定与病毒或疫苗反应后的中和抗体含量的方法显得尤为重要。
已经研究出了几种方法来改善蚀斑减少中和试验。
在微焦点减少中和试验（Jirakanjanakit等，1997）和荧光灶抑制试验（Thacker等，1978），聚焦灶可分别通过过氧化物酶以及抗过氧化物酶荧光染色技术看到。
然而，与噬斑减少中和试验相似，聚焦灶也必须人工计数。
另一组通过竞争ELISA来检测乙型脑炎病毒的特异性抗体（Chow等，1997）。
该法用三种单克隆抗体与测试血清竞争性结合包被在微滴度板上的乙型脑炎抗原。
此法虽然能够区分登革热抗体与日本脑炎病毒中和抗体，但不能检测所有类型的乙型脑炎病毒中和抗体。
为了解决上述缺点，经过多次改进研究出了一种简捷的方法，中和酶联免疫法，这种方法在其他病毒如麻疹（Lee等，1999）的检测中已经得到了应用。
方案如下：Vero细胞购自美国模式培养物保藏中心（ATCC编号：CRL-1586，Vero细胞-1008）。
乙型脑炎病毒（中山株）由陈佑昌教授提供。
（新加坡国立大学）。
细胞培养在199培养基（Gibco公司），加入0.042％的钠碳酸氢钠（Merck）和2mM HEPES（Gibco公司）并添加8％胎牛血清（Hyclone公司）。
维持液由1X的199培养基，0.028％碳酸氢钠和2mM HEPES并添加2％胎牛血清（FCS）配置成。
所用的血清在新加坡一个离岸的岛屿上从26头野生的猪体内取样获得。
本次试验进行了重复。
试验方案1.噬斑减少中和试验：次试验在24孔板中进行（Falcon）。
大约60μL热灭活的血清通过倍比稀释，从1:40到1:1280。
然后与60μL病毒液混匀（每孔为30-50 PFU）并在37°C孵育1小时。
然后取100 ml混匀后的液体加到融合有Vero细胞单层的24孔板中，在此之前用1 ml1X 的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养有Vero细胞的培养基一次，控制pH值为7.2。
设置的对照组包括：板孔中仅加入病毒（无血清）和板孔中仅加入细胞（无病毒或血清）。
然后把血清病毒混合液与细胞一起在37℃孵育1 h。
吸收步骤后，吸出混合液。
然后，1毫升1％的羧纤维素覆盖培养基在每个板孔中加入2％的FCS。
反应板置于37℃，5％CO2中孵育6天。
然后用1％的甲醛固定并用1％的龙胆紫染色。
经计算减少了70%。
2.酶联免疫法：确定病毒加入和孵化的时间。
要确定病毒加入和孵化的时间，将三个96培养板（Falcon）做如下准备：25μL经过倍比稀释的毒液与25μL维持液混匀后放在摇床上在37°C环境中孵育60分钟。
再添加50μLVero细胞悬液直至每个板孔中大约20000个细胞（细胞计数）。
培养板在37℃，5％CO2的环境下孵育2,3以及4天。
孵育后，弃掉培养液，培养板中加入100μL冷冻的80％的丙酮放在4°C冰箱中10分钟。
固定后，弃掉丙酮，烘干培养板，存放于20°C，直到使用。
在进行间接酶联免疫试验前，培养板放在室内直至室温，并用PBS/T冲洗一次（1×PBS与0.05％的Tween20）。
然后在每个板孔中加入100μL的鼠抗黄病毒的单克隆抗体（用PBS稀释为1:20）并在37℃摇床下孵育1小时。
单克隆抗体从Henchal （Henchal等，1982）培育的杂交瘤细胞ATCCHB-112中获得。
然后用PBS/T冲洗3次，加入100μL用1X PBS 1:5000稀释的过氧化物酶标记的驴抗鼠单克隆抗体（Chemicon公司）。
在37℃摇床上孵育1小时。
然后再冲洗三次，加入100μL二胺底物（Sigma公司），置于黑暗环境，室温下孵育15分钟。
加入50μL1N硫酸使反应终止。
读取其在490 nm处的吸光值。
阴性对照中，只加入细胞（不添加病毒）。
3.中和酶免疫法：约25μL倍比稀释的血清与25μL病毒液混匀（浓度与2中相同）后置于摇床中于37°C孵育1小时。
然后在每个板孔中加入50μL细胞液（每个板孔中约加入20 000个细胞）。
阴性对照仅加入细胞;阳性对照每个板孔中加入50μL病毒（增加的PFU）不加入血清。
培养板置于37℃，5％的二氧化碳中一段时间（与2中间接酶联免疫法描述的相同）。
然后，70％的终点减少计算公式如下：其中OD血清为样品孔的吸光值;OD细胞为细胞对照的吸光值（仅为细胞）；OD病毒为病毒对照的吸光值（细胞和病毒）的吸光值。
吸光值变化（490nm）和乙型脑炎病毒（PFU/孔）图表1：不同乙型脑炎病毒（Nakayama）量在490nm处的吸光度。
在孵育3天的时候，板孔中的病毒量（PFU/孔）与吸光值成线性关系。
阴性对照组（仅加入细胞）的平均吸光度小于0.13（Ting等）。
表1为：病毒在第2，3和4天中吸光值的变化。
只加入了细胞的阴性对照在试验中孵育的几天中吸光值均小于0.1。
经过2天的孵育，在加入12.5 PFU到2000 PFU不等的板孔中吸光值几乎没有任何变化。
表明长时间的孵育对于病毒蛋白在Vero细胞上的表达是十分必要的。
另一方面，孵育4天后吸光度降低而病毒滴度升高。
这是有可能由于孵育时间过长。
3天的孵育期是最好结果，吸光度读数随着病毒滴度的增加而升高。
结果显示了病毒滴度与吸光值之间的线性关系。
也表明，此法的检测限是每个板孔中添加20 PFU。
这是一个特殊的点，此时吸光度是只加入细胞的阴性对照的两倍。
因为吸光值减少70％被用来作为终点，一个合理的病毒起始浓度为每个板孔中100 PFU从而使吸光值在终点比只加入细胞的对照孔显著增大。
表2：蚀斑减少中和试验与中和免疫试验测定26份野猪血清样本的比较（此散点图通过SPSS生物统计分（R=0.783，R2=0.614，S.E.r=0.185，析软件生成）。
每个发散点代表一个样本。
外线划定为95％的置信区间。
t=6.174，P＜0.0001）（Ting等。
）下一步，进行中和酶联免疫终点和用野猪血清做的蚀斑减少中和试验之间的相关性检验。
结果如图2。
血清滴度用对数表示。
结果表明，用中和酶联免疫试验和蚀斑减少中和试验测得的野猪血清中的中和抗体滴度密切相关。
（R=0.783，R2=0.614，S.E.r=0.185），并且这种关联具有统计学意义（T=6.174，P<0.0001）。
在这个试验中，小鼠抗黄病毒单克隆抗体是检测乙型脑炎病毒抗原的一个主要抗体。
另外，乙型脑炎特异性单克隆抗体也可以作为检测乙型脑炎病毒抗原的抗体来使用。
然而，我们用登革热2型病毒和登革热2型特异性单克隆抗体进行的基础性研究表明，较少的特异性的抗黄病毒单克隆抗体可导致病毒感染的细胞和对照（仅有细胞）之间的吸光度值出现较大的差异。
因此，使用抗黄病毒的单克隆抗体的检测限较低。
进一步讲，此法可以很容易地进行改进，以检测其他黄病毒的中和抗体，如登革热和西尼罗河病毒。
蚀斑减少中和试验与中和免疫试验的比较（Ting等）与蚀斑减少中和试验相比，用中和免疫试验测定中和抗体耗时减少了一半。
蚀斑减少中和试验滴度的测定通过肉眼计数蚀斑，可能会有观察者的主观偏差。
中和免疫测定，利用分光光度计读取结果。
此外，该法进行了在96孔板中，从而在检测大量调查样本时更加经济、劳力密集程度更低。
因此，在大规模的疫苗效力检验、血清流行病学检测以及对乙型脑炎病毒中和抗体的定量等方面，中和免疫试验比蚀斑减少中和试验更加优异。
作为检测标准的蚀斑减少中和试验技术上有较高要求，并且并不适合于大规模的血清流行病调查研究。
而中和免疫试验突破了这些限制，是一种更加优秀的检测方案。