抗生素平板筛选（插入失活） 抗生素平板筛选（插入失活）
例题分析： 例题分析：
下图a示基因工程中经常选用的载体 pBR322质粒， pBR322质粒 下图a示基因工程中经常选用的载体—pBR322质粒， 表示氨苄青霉素抗性基因， 表示四环素抗性基因。 Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。 目的基因如果插入某抗性基因中，将使该基因失活， 目的基因如果插入某抗性基因中，将使该基因失活，而不 再具有相应的抗性。为了检查载体是否导入原本没有Amp 再具有相应的抗性。为了检查载体是否导入原本没有Ampr 的大肠杆菌， 和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培 养基上，得到如图b的结果（黑点表示菌落）。 ）。再将灭菌 养基上，得到如图b的结果（黑点表示菌落）。再将灭菌 绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落， 绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒 布平移按到含四环素的培养基上培养，得到如图c 布平移按到含四环素的培养基上培养，得到如图c的结果 空圈表示与b对照无菌落的位置）。据此分析并回答： ）。据此分析并回答 （空圈表示与b对照无菌落的位置）。据此分析并回答 与图c空圈相对应的图b 与图c空圈相对应的图b中的 菌落表现型是__________ __________， 菌落表现型是__________， 由此说明目的基因插入了 ____________中 ____________中。
存在下） （IPTG 存在下）
宿主： 编码β 宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C 苷酶C端序列
α-互补 细菌表达： β-半乳糖苷酶活性蛋白↑ 细菌表达： 半乳糖苷酶活性蛋白↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ 吲哚（
X-gal）
→
形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→ 当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→ DNA→β 不能与宿主β-半乳糖苷酶的 端进行α 互补→ 不能与宿主 半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落。 半乳糖苷酶的
目的基因 载体连接物 成的产物有 目的基因—载体连接物 、 载体 载体连接物 、 载体—载体连接物 目的基因—目的基因连接物 三种。 目的基因 目的基因连接物 三种。
（08年海南）如图为某种质粒表达载体简图， 08年海南）如图为某种质粒表达载体简图， 年海南 小箭头所指分别为限制性内切酶 EcoRI、BamHI的酶切位点， EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR 的酶切位点 为青霉素抗性基因， 为青霉素抗性基因，tetR为四环 素抗性基因， 为启动子， 素抗性基因，P为启动子，T为终 止子，ori为复制原点。 已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、 BamHI 止子， ori 为复制原点。 已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、 为复制原点 EcoRI 在内的多种酶的酶切位点。据图回答： 在内的多种酶的酶切位点。据图回答： （2 ）用上述三种连接物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实 验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核 之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，
表达载体模式图
真核生物基因表达载载体连接 反转录成互补DNA→与载体连接→ mRNA→反转录成互补DNA→物蛋白质 ） 2）同源序列杂交 ）
分离目的基因 的mRNA
逆转录生成cDNA单链 逆转录生成cDNA单链 cDNA
水解去除mRNA， 水解去除mRNA， mRNA
合成cDNA双链 合成cDNA双链 cDNA 水解回折处单链 得到平端双链cDNA 得到平端双链cDNDNA
载体—载体连接物 宿主细胞所含有的连接产物是 载体 载体连接物 ；若接种到含青
霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物 是 目的基因 载体连接物 目的基因—载体连接物 。
载体—载体连接物 载体 载体连接物
2 蓝-白筛选
它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法， 它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选 含有编码β 半乳糖苷酶的基因。 含有编码β-半乳糖苷酶的基因。 载体：编码β 载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列 苷酶 端序列
1 acctgtgaac ctgcggaagg atcattgcac acacgagttg cagccaaccc gcggcgaacg 61 aacacattgt ccctttcggt gggtcgtggc gccgcgcggc gtggcggccg gccactccct 121 ttgtcgtcac gagctcgctc gcgcgcggcg ttgggtttcc acgcgatgcc ttcaccttga 181 ccgaatgact cagtccctcg acttcgtagg aggattggga gttccgtccc ccttggcgcg 241 cttcgcttct taagggggtg ggcgtggtta ccacccgaat tgttaaaacg taatccaaaa 301 caactctcag caacggatat cttggctctt gcaacgatga agaacgcagc gaaatgcgat 361 acgta
基因工程相关问题解析
复兴中学 车未艾
Hale Waihona Puke 题一： 问题一：关于克隆载体与基因表达载体
（一）克隆载体 用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有3点特性： 用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有3点特性： DNA片段的载体 能够在受体细胞复制； ⑴ 能够在受体细胞复制； 带有药物抗性基因，便于筛选； ⑵ 带有药物抗性基因，便于筛选； 可导入受体细胞。 ⑶ 可导入受体细胞。 （二）表达载体 除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表 除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表 达构件——转录和翻译所必须的DNA顺序。 转录和翻译所必须的DNA顺序。 达构件 转录和翻译所必须的DNA顺序 是否含有表达系统元件，即启动子—核糖体 是否含有表达系统元件，即启动子 核糖体 结合位点--转录终止信号， --转录终止信号 结合位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载 体和表达载体的标志。 体和表达载体的标志。
问题三：关于重组DNA DNA的检测 问题三：关于重组DNA的检测
（一）平板筛选 （二）限制酶切图谱筛选 PCR筛选重组体 （三）PCR筛选重组体 （四）分子杂交技术
（一）平板筛选
是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。 是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。 如具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后， 如具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能 在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转 在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长； 化的则不能生长。 化的则不能生长。 1 插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内， 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使 DNA序列插入质粒中某一抗药基因内 该基因失活， 该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的 培养平板上。 培养平板上。
例题分析
（2009年天津）为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸 2009年天津）为从根本上解决水稻中的高植酸问题， 年天津 酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。 酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植 酸酶基因的流程。据图回答： 酸酶______；A、C过程中__________ 过程需要的酶是______________； ______________ 过程中__________ 可以/不可以）使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。 （可以/不可以）使用同一种探针筛选含______ _____________为模板直接进行PCR扩增 ___________和 为模板直接进行PCR扩增， 图中___________和_____________为模板直接进行PCR扩增， 该过程中所用酶的显著特点是_______________________ _______________________。 该过程中所用酶的显著特点是_______________________。
蓝－白筛选示意图
（二) 限制性内切酶图谱鉴定
（三)PCR筛选重组体 )PCR筛选重组体
抽提少量重组DNA→PCR扩增→电泳鉴定→序列分析。 抽提少量重组DNA→PCR扩增→电泳鉴定→序列分析。 DNA 扩增
（四)分子杂交或原位杂交技术
（a） ）
基因组DNA 基因组
DNA限制片段 限制片段
（b） ）
（c） ）
（d） ）
硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的 基因DNA片段 基因 片段 X光底片 光底片
克隆载体——pBR322 克隆载体——pBR322质粒 pBR322质粒
① 4363 bp ② 含一个复制点 ③ 含一个抗氨卞青霉素标 记(ampR) ④ 一个抗四环素标记 (tetR) ampR和tetR基因内各 ⑤ 有一些限制酶的酶切位点， 有一些限制酶的酶切位点， 供外源基因插入 当外原基因插入抗药 基因位点时， →Amp敏 基因位点时，AmpR→Amp敏 感(AmpS )、TetR→Tet敏 →Tet敏 感(TetS).
GenBank flat file: LOCUS DQ673108 365 bp DNA linear PLN 11-JUL2006DEFINITION Homaliodendron microdendron 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, complete sequence; and 5.8S ribosomal RNA gene, partial sequence. AUTHORS Che,W., Du,G. and Wu,P. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (05-JUN-2006) Biology, Capital Normal University
（08年海南）如图为某种质粒表达载体简图， 08年海南）如图为某种质粒表达载体简图， 年海南 小箭头所指分别为限制性内切酶 EcoRI、BamHI的酶切位点， EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR 的酶切位点 为青霉素抗性基因， 为青霉素抗性基因，tetR为四环 素抗性基因， 为启动子， 素抗性基因，P为启动子，T为终 止子，ori为复制原点。 已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、 BamHI 止子， ori 为复制原点。 已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、 为复制原点 EcoRI 在内的多种酶的酶切位点。据图回答： 在内的多种酶的酶切位点。据图回答： （1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶 将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切， DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切 切产物用DNA连接酶进行连接后 其中由两个DNA DNA片段之间连接形 切产物用DNA连接酶进行连接后， 其中由两个 DNA 片段之间连接形 DNA 连接酶进行连接后，