E. coli B含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
当λ(k)噬菌体侵染E. coli B时，由于其DNA中 有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E. coli B的DNA中虽然也存在这种特异序列， 但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫 氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特 定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲 基化的序列。
基因重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因 与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受 体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或 新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
供体、受体和载体是重组DNA技术的三大基本元件。
基因工程的目的：
分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 大规模生产生物活性物质 设计、构建生物的新性状甚至新物种
反应必须ＡＴＰ和Ｍｇ２＋，具有特异性识别部位 并切割。 如EcoR I、Hinf III III 型限制酶的基本特点：
可以识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端2426bp处切开DNA，切割位点没有特异性。
2、限制性核酸内切酶的命名原则
第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一 个字母。 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、 二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。
⑶核酸内切限制酶对生物基因组的消化作用
小分子量的片断-----少 （电泳-容易分离目的片 断）cheria coli RY13的第一个限制
酶。
3、限制性内切酶作用后的断裂方式
形成粘性末端； 形成平末端；
粘性未端：切开后的两段DNA各留下一个尾，这2 个尾的核苷酸顺序完全一样，方向相反。它们之 间是互补的，在适当条件下可以再连接一起。
Sel I CGCG Tha I CG CG
5、影响核酸内切酶活性的因素
⑴DNA的纯度
DNase的污染(Mg2+) a.增加核酸内切限制酶的用量 b.扩大酶催化反应的体系（稀释） c.延长酶催化反应的保温时间 加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度。
⑵DNA的甲基化程度 ⑶酶切消化反应的温度
大多数酶的标准反应温度37℃。
⑷DNA的分子结构
基因工程及其应用
第5章 基因工程及其应用
一 基因工程概述 二 基因工程工具酶 三 克隆载体 四 微生物作为克隆载体的宿主 五 基因工程的常用技术和方法
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应 用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游 技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建 （重组DNA 技术）；下游技术涉及到基因工程菌或 细胞的大规模培养及基因产物的分离纯化过程。
二 基因工程常用的工具酶
基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微 生物中分离和纯化而获得的。
包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合 酶、逆转录酶等。
限制（restriction)与修饰 (modification) 体系 (R/M )：
寄主是由两种酶活性配合完成的: 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
R/M体系的作用：
⑴保护自身的DNA不受限制； ⑵破坏外源DNA使之迅速降解。
（一） 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
1、核酸限制性内切酶的分类 I 型限制酶的基本特点:
反应必须S-腺苷基蛋氨酸、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋，有 特异识别位点但没有特异切割位点，切割是随机的。 如EcoB和EcoK II 型限制酶的基本特点：
大规模生产生物活性物质
天然细胞
分离工程
分
离
酶
工
程
酶工程
天然细胞
基因工程 蛋白质工程 途径工程
工程细胞
发酵工程 细胞工程
生物活性物质
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程 第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程 第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因组工程
同裂酶(来源不同但识别相 同靶序列)
Sau3A I GATC
同尾酶(来源不同，识别 靶序列不同但产生相同粘 性末端)
CTAG
BamH I GGATCC
CCTAGG
4、限制片断的末端连接作用
分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性 末端之间的碱基配对而彼此连接起来。
分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之 间的碱基配对而形成的环形分子。
维持酶的稳定性。 ｄ. 牛血清蛋白（BSA） ：维持酶的稳定性。
６、核酸内切限制酶对DNA的消化作用
⑴核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发
生作用。
⑵核酸内切限制酶对DNA的局部消化
完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切 限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次 的水平。
局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的 DNA消化完全，就可以获得平均分子量大小有 所增加的限制片断产物，进行不完全的限制酶消 化反应。 a. 缩短酶切的消化反应的保温时间 b. 降低反应的温度（37--4）结束酶的活性
某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒 DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。
⑸核酸内切限制酶标准的缓冲液 ａ. 氯化镁、氯化钠或氯化钾：
不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性， 还可能导致识别序列的改变。 ｂ. Tris-HCl ： 维持最适的pH值（ pH ＝7.4）。 ｃ. β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT） ：
一 基因工程育种
是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因， 再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至 新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表 达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优良性状 经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。
基因克隆过程：
１、获得待克隆的DNA片段（基因）； ２、目的基因与载体在体外连接； ３、重组DNA分子导入宿主细胞； ４、筛选、鉴定阳性重组子； ５、重组子的扩增与／或表达。