模板浓度过高会抑制PCR
NTC sample 1 sample 1 sample 2 sample 2 original 1:1 0 original 1:10
Template DNA
undiluted and 1:10 dilution
Format SYBR Green I LIghtCycler® DNA Master
引物3’端最后5个碱基有2个以上的G或C 引物3’端最后1个碱基为A
GC含量
40 - 60 % GC GC/AT分布大致均衡,C含量>G
65－70°C
探针复性温度
引物复性温度
60－65°C
3
3
PCR引物与探针
标记 PCR产物长度 淬灭基团采用无荧光背景的如BHQ, 不要用tamra 50－150bp


NTC (no template control) for each primer pair positive control (if available)
MgCl2 Concentration: 2 - 5 mM
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Basic Optimization in PCR
Use any template nucleic acid (NA) suitable for PCR, sufficiently purified and free of PCR inhibitors

melting curve (杂交探针等模式): 突变检测或亚型分析
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Standard Conditions in PCR
Template Primers Probes Controls
DNA or cDNA 0.5 µM each (final concentration) 0.2 µM each (final concentration)
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PCR的建立与优化
PCR试剂体系
引物、探针的设计
核酸纯化与逆转录
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建立新的PCR体系:
General Hints
模板 - DNA或 cDNA 为模板
对照 - NTC (no template control) 每个探针引物组合 - 阳性对照 (如果可能) 分析 - 扩增: sensitivity and efficiency of PCR (crossing points) - 熔解曲线分析 (SYBR Green I format):检测引物二聚体或其 它非特异性扩增 凝胶电泳: 验证非特异性扩增
Design
primer design software，选择序列保守区域
如果保守区域太短，可以在引物中考虑引入
LNA提高Tm
探针可以考虑引入LNA或改用MGB或自淬灭 taqman探针
简并引物或探针需要同时考虑多种情况下的Tm高低4PC Nhomakorabea引物与探针
• SNP的Taqman双色检测中，突变探针一般Fam标记
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Basic Optimization:
MgCl2 Titration
• MgCl2 Titration: 2 - 5 mM
• Format: SYBR Green I • LC FastStart DNA Master
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Basic Optimization:
Template Concentration
Example: Universal ProbeLibrary assay
• Higher primers/probe concentrations give better signal to noise ratio (higher fluorescence signal intensitiy)
• Only minor influence on Cp when used in medium concentration ranges
NA Storage Store nucleic acids in high concentrations and aliquots For low template concentrations, use siliconized tubes and add carrier NA (10 ng/µl), e.g. MS2 RNA
Template Concentration: genomic DNA
plasmid DNA RNA cDNA and 1:100 dilutions
建议测试多个稀释度 (最少2个梯度,10^2) 50 ng - 5 pg
approx. 106 copies ≤ 500 ng total RNA or 100 ng mRNA ≤ 50 ng equivalent of total RNA ，RT product undiluted, 1:10
荧光定量PCR实验设计及优化
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PCR的建立与优化
PCR试剂体系
引物、探针的设计 核酸纯化与逆转录
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PCR引物与探针
长度 序列 16 - 24 bases（引物） 不能有以下情况： 任意2个引物或探针之间的序列互补 引物或探针本身有二级结构
连续的> GGG，引物的5’端有G
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SYBR Green I Format PCR Analysis Example
模板拷贝数越低，越容易出现引物二聚体
Quantification
Melting Curve Analysis
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Optimization:
Influence of PCR Inhibitors
• 相对定量分析中内参基因一般Hex标记 (例如Roche的UPL相对定量解决方案)
• 对检测要求更高的建议Fam标记(灵敏度或者 定量 vs 定性) 扩增效率较差的建议Fam标记
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Reaction Conditions
Primers and Probes
Concentration Range (final con.) • Primers: 0.1 µM – 1.0 µM each • Probes: 0.1 µM – 0.5 µM Standard Concentrations (final conc.) • Primers: 0.5 µM each • Probes: 0.2 µM