GPNMB促进周围神经损伤修复的作用及其机制周围神经损伤是临床常见损伤,损伤后的再生修复涉及很多因素,其中施万细胞(Schwann cells,SCs)在周围神经损伤修复中发挥着重要的作用。
周围神经损伤后,SCs通过上调多种神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)和粘附分子的表达,并在损伤局部募集巨噬细胞,与巨噬细胞共同吞噬裂解的轴突和髓鞘,改善再生微环境;在基膜内形成Büngner’s带,引导轴突再生;轴突再生后,SCs 包绕其形成髓鞘,促进神经功能恢复。
损伤远侧端SCs长期失神经,则导致周围神经再生能力下降,影响神经修复。
因此,激活失神经SCs,促进SCs增殖、分化、迁移、表达和分泌NTFs等,或者通过补充外源性营养因子、小分子物质等改善再生微环境,是治疗周围神经损伤的重要策略。
非转移性糖蛋白黑色素瘤蛋白B(Glycoprotein Non-Metastatic Melanoma Protein B,GPNMB),也叫骨活化素(osteoactivin,OA)、树突状细胞肝素整合素配体(dendritic cell-heparin integrin ligand,DC-HIL)、造血生长因子诱导的神经激肽-Ⅰ型(hematopoietic growth factor inducible neurokinin-Ⅰtype,HGFIN),是一种Ⅰ型跨膜蛋白,最早发现于黑色素瘤细胞中。
GPNMB广泛分布于中枢神经系统,具有非常重要的作用:如改善记忆、抗炎、减少神经元死亡、保护神经元。
GPNMB在周围神经系统特别是SCs也有表达,然而,它对SCs和周围神经系统是否有激活或者保护作用,以及在周围神经再生修复中的作用仍不清楚。
基于以上考虑,本研究通过对坐骨神经损伤后远侧端进行基因芯片分析,了解GPNMB在周围神经损伤后的表达变化,并探讨GPNMB对周围神经损伤再生修复的作用和对SCs的作用及其机制,为GPNMB的临床应用提供理论和实验基础。
第一部分坐骨神经损伤后GPNMB的表达变化目的:通过对坐骨神经损伤后远侧端进行基因芯片分析,以了解损伤神经远侧端基因表达变化,尤其是GPNMB的表达变化。
方法:对坐骨神经横断伤后0、1、3、7、14、21、28 d,远侧端进行基因芯片分析,STEM分析筛选表达变化趋势显著性的基因集,并对其进行生物信息学分析和聚类分析。
筛选出其中变化最明显的基因,并使用qRT-PCR、免疫印迹(Western bloting,WB)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)对其在转录和蛋白水平进行验证。
结果:在坐骨神经横断损伤后0、1、3、7、14、21、28 d,远侧端基因表达趋势显著性的基因集共有12个,其中基因集41的表达趋势在坐骨神经损伤后先上升、至峰值、继而下降,而这种变化趋势与远侧端急性失神经SCs的增殖趋势相一致。
GO、KEGG分析预测基因集41中的基因可能参与细胞增殖过程。
聚类分析发现GPNMB是基因集41中表达变化最明显的基因,其表达从1 d开始上升、从3 d 开始迅速上升,至7 d时上升至峰值,约为0 d的48倍、从14 d开始下降,直至28 d下降至0 d的15倍左右。
qRT-PCR、WB、IHC结果显示GPNMB的表达趋势和芯片结果基本一致。
结论:在坐骨神经损伤后,损伤远侧端GPNMB表达变化最明显,且呈先上升、至峰值、继而下降的趋势,GPNMB可能参与坐骨神经损伤后的自我再生修复过程,尤其是细胞增殖的过程。
第二部分GPNMB促进坐骨神经损伤再生修复目的:探讨GPNMB对坐骨神经损伤再生修复的作用方法:坐骨神经重度压榨伤模型建模后3周,于损伤处由远及近、多点注射重组人GPNMB(rhGPNMB)蛋白或PBS,实验大鼠共分为3组:PBS组、100ng rhGPNMB组、500ng rhGPNMB组,并于4周后进行检测。
免疫荧光检测SCs 增殖及轴突、髓鞘的再生;透射电镜观察髓鞘的超微结构并计算G-Ratio值;体外检测损伤神经兴奋传导速度和动作电位振幅;注射rhGPNMB后的每周观察大鼠行走足印、计算坐骨神经功能指数,检测神经功能恢复情况;观察腓肠肌大体形态、对腓肠肌称重、HE染色检测其萎缩情况。
结果:rhGPNMB组SCs数目、再生轴突数、再生髓鞘数以及增殖细胞核抗原的表达均明显多于PBS组,差异具有统计学意义。
100ng rhGPNMB组和500ng rhGPNMB组的SCs数量分别为PBS组的1.55±0.21和2.75±0.28倍,且形状和排列上更加规则;再生轴突数为PBS组的1.38±0.19和1.78±0.18倍,且分布更加均匀、直径更大、延续性更完整;再生髓鞘数分别为PBS组的1.18±0.18、1.67±0.08倍,且完整性更好、分布更加均匀。
透射电镜结果显示:rhGPNMB组再生髓鞘数多于PBS组,形状更加完整、髓鞘板层较厚且更加致密,微管、微丝等超微结构排列更规则。
计算G-Ratio值,500ng rhGPNMB组G-Ratio值最小,表明其再生髓鞘厚度最厚,差异具有统计学意义。
体外检测发现,100ng rhGPNMB和500ng rhGPNMB两组的动作电位振幅分别为PBS组的1.10±0.22和1.44±0.30倍;神经兴奋传导速度分别为PBS组的1.32±0.08、2.15±0.17倍,差异具有统计学意义。
按照3组大鼠行走足印,计算坐骨神经功能指数,PBS、100ng rhGPNMB、500ng rhGPNMB 3组坐骨神经功能指数均有降低,至第4周3组的坐骨神经功能指数值分别为-72.83±5.85、-60.06±4.77、-40.60±5.00,差异具有统计学意义,表明坐骨神经在损伤再生修复过程中,3组神经功能均有一定的恢复,而rhGPNMB可促进坐骨神经损伤后功能的进一步恢复。
大体形态观察发现rhGPNMB组腓肠肌萎缩较PBS组轻,尤其是500ng rhGPNMB 组。
PBS、100ng rhGPNMB、500ng rhGPNMB组腓肠肌质量分别为正常腓肠肌质量的(44.68±4.08)%、(54.55±3.05)%、(66.85±4.10)%,差异具有统计学意义。
横切面HE结果显示rhGPNMB组肌纤维直径和截面积显著大于PBS组,尤其是500ng rhGPNMB组,差异具有统计学意义。
结论:GPNMB促进损伤坐骨神经SCs增殖、轴突再生以及损伤神经再髓鞘化;改善其电生理特性;促进损伤坐骨神经的功能恢复,延缓腓肠肌萎缩。
总之,GPNMB促进损伤坐骨神经再生修复。
第三部分GPNMB对SCs的作用及其机制目的:探讨GPNMB对SCs的作用及其机制。
方法:在施万细胞系RSC96培养基中分别加入12.5ng/ml或25ng/ml rhGPNMB,CCK8法和WB检测RSC96的增殖;TUNEL实验检测RSC96的凋亡;细胞划痕法检测RSC96的迁移;qRT-PCR、WB、ELISA检测RSC96 NTFs和粘附分子的表达和分泌;WB检测Erk1/2、Akt磷酸化;免疫共沉淀、免疫荧光双标检测rhGPNMB 与RSC96胞膜上哪种蛋白结合;使用该蛋白拮抗剂或干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)慢病毒与rhGPNMB共同处理RSC96,CCK8法、细胞划痕法、WB、ELISA分别检测RSC96的增殖、迁移、以及NTFs和粘附分子表达、分泌;WB检测Erk1/2、Akt磷酸化。
结果:RSC96在加入rhGPNMB培养1 d时,增殖无明显变化;从2 d开始,增殖明显高于对照组;培养3 d时,rhGPNMB组RSC96增殖细胞核抗原表达明显高于对照组,尤其是25ng/ml rhGPNMB组。
25ng/ml rhGPNMB组增殖明显快于12.5ng/ml rhGPNMB和对照组,差异具有统计学意义。
rhGPNMB对RSC96凋亡无明显作用。
25ng/ml rhGPNMB组划痕修复速度较快,在48 h时,修复达到(70.35±0.20)%,高于12.5ng/ml rhGPNMB组的(59.74±1.76)%和对照组的(41.23±0.82)%,差异具有统计学意义。
rhGPNMB促进NGF、BDNF、NT-3和N-cadherin在转录、蛋白水平的表达和分泌。
同时25ng/ml rhGPNMB组p-Erk/total-Erk、p-Akt/total-Akt分别为对照组的4.20±0.21、2.58±0.52倍,亦高于12.5ng/ml rhGPNMB组,差异具有统计学意义。
免疫共沉淀结果显示rhGPNMB和NKAα1可共沉淀,免疫荧光双标结果显示rhGPNMB和NKAα1共定位于RSC96胞膜上,这说明rhGPNMB结合RSC96胞膜上的NKAα1。
NKA拮抗剂Ouabain和rhGPNMB共同处理RSC96时,RSC96增殖速度、划痕修复速度、NTFs和N-cadherin的表达和分泌、p-Erk/total-Erk、p-Akt/total-Akt 与单用rhGPNMB相比明显降低,差异具有统计学意义,而与对照组和单用Ouabain 无明显差异。
NKAα1 siRNA和rhGPNMB共同处理RSC96时,NKAα1 siRNA+rhGPNMB 组RSC96增殖速度、划痕修复速度、NTFs和N-cadherin的表达和分泌、p-Erk/total-Erk、p-Akt/total-Akt低于rhGPNMB、NC siRNA+rhGPNMB组,但是高于其他3个非rhGPNMB处理组,差异具有统计学意义。
结论:GPNMB可能通过结合SCs胞膜上NKAα1,通过促进Erk1/2、Akt磷酸化,进而促进SCs的增殖、迁移、表达和分泌神经营养因子和粘附分子。