- AT产生缓慢的酶解 ,α1 - AT构象由 S型向 R 型转换 ,封 闭了蛋 白 酶 的 反 应 中 心 从 而 达 到 抑 制 蛋 白 酶 活 性 的 作
用 [2, 4 ] 。
1 α1 - 抗胰蛋白酶的理化性质及作用机制
2 α1 - 抗胰蛋白酶的遗传特征和基因多态 性
α1 - AT为单链糖蛋白 ,肽链由 394个氨基酸残基组成 , 肽链 中 含 有 43 个 A sn /A sp 残 基 , 但 仅 在 A sn46、A sn83、 A sn247上连接有寡糖链 ,其中一个糖链为三叉寡糖链 ,另外 2个为双叉寡糖链 ,糖含量为 12% ～14%。α1 - AT的分子 量为 45～56KDa,等电点为 p I4. 7～5. 0,正常人血浆中 α1 AT的含量为 (2. 90 ±0. 45) g /L ,在体内的半衰期为 3 ～5 d, 然而 α1 - AT的含量随蛋白酶抑制剂表型不同而不同 。α1
第 5期 α1 - 抗胰蛋白酶的研究进展
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或多或少 的 都 将 表 现 出 遗 传 性 血 浆 α1 - AT 水 平 低 下 。 PiZZ个体中血浆的 α1 - AT水平仅为 PiMM 的 15% , PiSS为 60% , PiZS为 35% ,其中 PiZ变体是 α1 - AT缺乏最常见的 原因 。与正常 PiMM 型相比 ,肝细胞 PiZZ型 α1 - AT的侧糖 链缺乏半乳糖和唾液酸 ,而甘露糖明显高于 PiMM 型 。有缺 陷的糖基化影响了 PiZZ型 α1 - AT由粗糙内质网向光滑内 质网的迁移 ,最终导致 PiZZ型 α1 - AT形成聚合体在肝细 胞内质网上的沉积 ,同时变异导致了 α1 - AT合成过程中的 糖基化异常 ,使 α1 - AT的 分 泌 减 少 、在血 浆 中 的 含 量 降 低 。 [ 1, 5 ]
(1. 陕西师范大学生命科学学院 ,陕西西安 710062; 2. 西安回天血液制品有限责任公司 ,陕西西安 710075)
摘 要 :α1 - 抗胰蛋白酶是人体内一种主要的蛋白酶抑制剂 ,与肺气肿 、肝脏硬化等疾病的发生密 切相关 。笔者对 α1 - 抗胰蛋白酶的理化性质 、作用机制 、分子遗传 、与疾病的关系以及分离纯化等方面 进行了综述 。
收稿日期 : 2009 - 04 - 22. 作者简介 :权燕敏 (1984 - ) ,女 ,陕西渭南人 ,硕士研究生 ,现从事动物毒素的分子生物学研究
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第 16卷第 5期 2009年 5月
现 代 农 业 科 学
Modern Agricultural Sciences
Vol. 16 No. M ar. 2009
5
α1 - 抗胰蛋白酶的研究进展
权燕敏 1 ,张卫柱 2 ,李灵君 2 ,王 颖 1 ,郜 瑞 1 , 杨章民 1
到工业制备规模 。其工艺为 :采用 N itchman和 Kistler低温 乙醇法的组分 A 上清 (相当于 Cohn氏低温乙醇法的 FⅡ + Ⅲ上清 ) ,经 DEAE - Sepharose CL - 6B 层析柱和 Sephacryl S
- 200凝胶过滤 ,得到的 α1 - AT经 60℃、10 h巴氏灭活处 理 ,冻干得成品 。该法的 α1 - AT回收率达 65% ～75% ,纯 度为 80% ～90%。Chen[13 ]等报道了采用离子交换层析技术 从 FⅣ - 1中提取纯化 α1 - AT纯化的工艺 ,并探讨了巴氏 灭活法 、干热灭活法 、S/D 灭活法等病毒灭活过程的差异和 优缺点 。Chen SX[14 ]等利用层析法从溶解的 FⅣ - 1组分中 纯化人 α1 - AT,其过程包括 DEAE层析 、S - 阳离子交换层 析 、TNBP - 胆酸盐处理 、再次阳离子交换层析 、冷冻干燥 。 TNBP - 胆酸盐之后的处理对于产品的低脂含量是关键的一 步 ,最终产品的纯度近 95% ,产率为 64% ～70%。M attes[15 ] 等报道了采用超滤 、层析等技术从 FⅣ - 1, 4组分中制备 α1
的活性 ,保护肺部不受弹性蛋白酶的酶解损伤 。α1 - AT抑 制蛋白酶的过程是一个自毁模式的反应过程 ,α1 - AT除了 被其捕获的蛋白酶缓慢裂解外 ,同时 α1 - AT - 蛋白酶复合 物能被吞噬细胞识别 、吞噬 、从血浆中清除 。在酶抑制过程 中 ,α1 - AT与蛋白酶活性中心的结合模式与蛋白酶 - 底物 的结合模式相似 。α1 - AT捕获目标酶 ,并与目标酶结合形 成 α1 - AT - 蛋白酶 1: 1的共价复合物 ,蛋白酶对结合的 α1
(1 College of L ife Science , Shaanxi Normal University, Xiππan 710062; 2 Xiπan Hui Tian B lood Products Co. , L td , Xiπan 710075, China)
Abstract:α1 - antitryp sin is the major p rotease inhibitors of human p lasma p rotein, It has close relationship w ith emphysema, liv2 er sclerosis and other diseases. Here, we briefly review the research p rogress ofα1 - antitryp sin, including the physical and chem ical
α1 - 抗胰蛋白酶 (α1 - antitryp sin, α1 - AT) ,又称 α1 蛋白酶抑制剂 (α1 - p rotease inhibitor, α1 - P I) 。它是人类 血浆中最重要的蛋白酶抑制剂 ,占血浆总蛋白酶抑制能力的 90%以上 。它能抑制多种丝氨酸内切肽酶 ( serine endopep ti2 dase) ,如中性粒细胞弹性蛋白酶 (NE) 、胰蛋白酶 、血浆素 、 凝血酶等 ,其主要作用是保护机体正常细胞和器官不受蛋白 酶的损伤 ,抑制感染和炎症 ,维持机体内环境的平衡 。血浆 中的 α1 - AT主要由肝脏产生 ,其它如肠 、肾 、脾等也能产生 少量的 α1 - AT,这些肝外合成的 α1 - AT在局部组织损伤 的调节中起重要作用 [1, 2 ] 。
关键词 :α1 - 抗胰蛋白酶 ;肺气肿 ;分离纯化 中图分类号 : Q553 文献标识码 : A 文章编号 : 1005 - 4650 (2009) 05 - 0014 - 03
Research Progress ofα1 - an titrypsin
QUAN Yan - m in1 , Zhang W e i - zhu2 , L I L ing - jun2 , W ANG Y ing1 , GAO Ru i1 , Yang Zhang - m in1
3 α1 - 抗胰蛋白酶与疾病的关系
α1 - AT缺乏直接相关的疾病主要是肺气肿和肝脏硬化 。 肺气肿是伴随有末端气室壁毁坏 、与末端气室扩张有关的慢 性支气管失常 。1963年 Laurell等首先发现 α1 - AT缺乏与 青年期肺气肿密切相关 。 Gadek等发现 α1 - AT承担了肺部 绝大部分的抗胰蛋白酶活性 。由于缺乏 α1 - AT减弱了支气 管壁对嗜中性细胞释放的弹性蛋白酶的防护能力 ,导致肺部 蛋白酶 - 抗蛋白酶系统的严重失衡 ,严重的 α1 - AT缺乏患 者的肺部因弹性蛋白酶的不断水解破坏导致损伤 。肺气肿是 一种常见疾病 [6 ] ,但仅有 1% ～2%的病例与遗传缺陷有关 , 最主要是由于严重吸烟 。吸烟能促使肺泡巨噬细胞释放中性 粒细胞趋化因子 ,刺激中性粒细胞释放大量的弹性蛋白酶 。 另外 ,烟草中含有的氧化剂可以氧化 α1 - AT的活性中心 ,从 而抑制 α1 - AT的活性 ,造成蛋白酶 - 抗蛋白酶系统失衡 ,最 终导致肺气肿的产生 [7, 8 ] 。 Z型 α1 - AT在肝细胞内的沉积 非常明显 ,形成的不溶聚集体可由显微镜观察 。部分变异型 α1 - AT在合成过程中可加工完全并分泌到血液中 ,而大部分 则在其糖基化过程中停止下来并发生聚集 ,在内质网上沉积 , 从而导致肝细胞损伤 ,引发肝脏硬化 。另外 ,α1 - AT缺乏还 会导致肺囊性纤维化 、急性肺损伤 、肿瘤和皮肤脂膜炎等疾 病 。目前 α1 - AT主要用于因遗传性 α1 - AT缺乏引起的肺 气肿患者的终身替补治疗和肺部炎症性疾病的防止 ,如慢性 阻塞性肺气肿 、肺囊性纤维化 、急性肺损伤等 [1 ] 。
4 α1 - 抗胰蛋白酶的纯化及制备
为了满足因遗传性 α1 - AT缺乏引起肺气肿患者终身 替补治疗和肺部炎症性疾病防治的需要 ,许多学者致力于研 制 α1 - AT制剂并已成功应用于临床 。
Cadek[9 ]等运用两步沉淀法制备临床应用的 α1 - AT浓 缩制剂 ,α1 - AT仅占浓缩制剂蛋白总量的 5%。 Glaser[10 ] 等建立了较为独特的 α1 - AT分离纯化工艺 ,利用 α1 - AT 的 Cys残基并未在肽键内形成二硫键这一特性 ,采用二硫苏 糖醇处理综合硫酸铵沉淀 ,经 DEAE - 纤维素层析步骤 ,从 Cohn氏低温乙醇工艺的废弃组分 FⅣ - 1中分离出纯度达 70%的 α1 - AT浓缩制剂 。Coan[11 ]等将 60℃、10 h病毒灭 活方法应用到 α1 - AT的制备工艺中 ,巴氏灭活前后 α1 AT的活性回收达 90%以上 。病毒灭活过程的引入是 α1 AT浓缩制剂在临床上的应用更加安全可靠 。随着层析分离 技术的发展 , 商 业性 制 备 α1 - AT的 工 艺 随 之 成 熟 起 来 。 Байду номын сангаасurnouf等 [12 ]综合 N itchman和 Kistler低温乙醇工艺 - 柱层 析工艺 ,制备 α1 - AT浓缩制剂 ,血浆处理量达 20 L ,基本达