乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验
YLNB 4.6 1. 仪器及器材
1.1 恒温培养箱：30±1℃、24±1℃
1.2 恒温水浴锅：46±1℃。
1.3 显微镜：10×～100×
1.4 离心机：4000 r/min
1.5 均质器或灭菌乳钵。
1.6 灭菌平皿：直径90mm。
1.7 灭菌试管： 16mm×160mm
1.8 灭菌吸管：1mL（具有0.01mL刻度）、10mL（具有0.1mL 刻度）。
1.9 冰箱：0－4℃
1.10 锥形瓶：100mL、500mL。
1.11 架盘药物天平：0g～500g,精确至0.5g。
1.12 离心管：30mm×300mm。
1.13 灭菌注射器：1
1.14 单核细胞增生李斯特氏菌标准株。
1.15 马红球菌。
1.16 小白鼠：16g～18g。
2. 培养基和试剂
2.1含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤(TSB－YE)：见附录
A1。
2.2含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂(TSA－YE)：见附录
A2。
2.3 EB增菌液：见附录A3。
2.4 LB增菌液(LB1，LB2)：见附录A4。
2.5 三糖铁(TSI)琼脂：GB/T4789.28中4.26，4.27。
2.6 SIM动力培养基：见附录A5。
2.7 血琼脂：GB/T4789.28中4.6。
2.8 改良的Mc Bride(MMA)琼脂：见附录A5。
2.9 硝酸盐培养基：GB/T 4789.28中
3.17。
2.10 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)：GB/T4789.28中
3.4。
2.11 糖发酵培养基：GB/T4789.28中
3.2。
2.12 过氧化氢酶试验：GB/T4789.28中4.38。
2.13 盐酸吖啶黄(AcriflavineHCl)(Sigma)。
2.14 萘啶酮酸钠盐(Naladixicacid)(Sigma)。
3. 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下：
检样25g(ml)
EB增菌液225ml LB1增菌液225ml
30
℃,48h 30℃,24h
3
0℃,24h
30℃,24
～48h
25℃ 2d ～5d(伞状)
30℃,24h
30℃,24h
LB2增菌液225ml
选择性培养基(MMA)
SIM 动力培养基 TSI 琼脂
TSA-YE 培养基
显微镜下观察
运动
硝酸盐还原实验 过氧化氢酶实验 甘露醇 木醇 鼠李糖 七叶苷 溶血实验
协同溶血实验 小鼠致病力实验 革
兰
氏染
色 MR-VP 实验
4. 方法
4.1 样品的收集及处理
无菌取样品25g(mL)放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。
如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。
4.2 增菌培养
EB增菌液放30±1℃培养48h，LB1增菌液225mL放30±1℃，培养24h，吸取0.1mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。
4.3 分离培养
将EB增菌液和LB2二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30±1℃ 48h，挑选可疑菌落，用白炽灯45°角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形的菌落。
4.4 选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁(TSI)琼脂和SIM 动力培养基，培养于25±1℃，观察是否有动力，且成伞状或月芽状生长。
一般观察2～7d，阳性者可做下一步鉴定。
4.5 纯培养
将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA－YE)上，做纯培养供做以下鉴定。
4.6 染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为0.4～0.5μm×0.5～
2.0μm；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观
察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
4.7 生化特性
将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及有关菌的区别见表1。
表1单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别
菌种溶血反应硝酸盐还原尿素酶 MR-VP 甘露醇
鼠李糖木糖七叶苷
单核细胞增生李斯特氏菌
+ - - +/+ - + - +
绵羊李斯特氏菌+ - - +/+ -
- - +
英诺克李斯特氏菌 - - - +/+ - V - +
威尔斯李斯特氏菌 - - - +/+ - V + +
西尔李斯特氏菌 + - - +/+ -
- + +
格式李斯特氏菌 - - - +/+ +
- - +
默氏李斯特氏菌 - + - +/+ +
V - +
注：V反应不定；+阳性；-阴性。
4.8 对小鼠的致病力试验
将符合上述特性的纯培养物接种于TSB－YE中，在30℃培
养24h，离心，浓缩，使浓缩液每毫升1010/mL个细菌，取0.5mL
浓缩菌液注射小白鼠腹腔，3～5只，观察小鼠死亡情况。
致病
株于2～5d内死亡。
试验时可用已知菌作对照。
单核细胞增生
李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌对小鼠有致病性。
4.9 协同溶血试验(cAMP)
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌
(R.equi)，在它们中间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及
它们，在30℃培养24～48h，检查平板中垂直接种点对溶血环
的影响。
靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌
的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，而绵羊李斯特氏
菌在马红球菌附近的溶血增强，有助于鉴别。
附录A
培养基
(补充件)
A1 含0.6%酵母漫膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB－YE)
A1.1 成分
胰胨17g
多价胨3g
酵母膏6g
氯化钠5g
磷酸氢二钾 2.5g
葡萄糖 2.5g
蒸馏水1000mL
A1.2 制法
将上述各成分加热搅拌溶解，调至pH7.2～7.4，分装，121℃灭菌15min，备用。
A2 含0.6%酵母膏胰酪胨大豆琼脂(TSA－YE)
A2.1 成分
胰胨17g
多价胨3g
酵母膏6g
氯化钠5g
磷酸氢二钾 2.5g
葡萄糖 2.5g
琼脂15g
蒸馏水1000mL
A2.2 制法
将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至7.2～7.4，分装，121℃高压灭菌,备用。
A3 EB增菌液
A3.1 成分
胰胨17g
多价胨3g
酵母膏6g
氯化钠5g
磷酸氢二钾 2.5g
葡萄糖 2.5g
蒸馏水1000mL
盐酸吖啶黄15mg/L
萘啶酮酸40mg/L
A3.2 制法
除吖啶黄和萘啶酮酸外，其余成分加热混合调pH至7.2～7.4，121℃15min高压灭菌。
使用前加吖啶黄溶液15mg/L和萘啶酮酸溶液40mg/L，此两种成分要无菌配制或过滤除菌。
A4 李氏增菌肉汤(LB1，LB2)
A4.1 成分
胰胨5g
多价胨5g
酵母膏5g
氯化钠5g
磷酸二氢钾 1.35g
磷酸氢二钠12g
七叶苷1g
蒸馏水1000mL
A4.2 制法
将上述成分加热溶解，调pH至7.2～7.4，分装，121℃15min 高压灭菌。
A4.2.1 李氏I液(LB1)225mL中加入：
1%萘啶酮酸(用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制) 0.45mL
1%吖啶黄(用灭菌蒸馏水配制) 0.27mL
A4.2.2 李氏Ⅱ液(LB2)200mL中加入：
1%萘啶酮酸 0.40mL
1%吖啶黄 0.50mL
无菌分装于10mL大试管中。
A5 改良的Mc Bride琼脂(MMA)
A5.1 成分
胰胨5g
多价胨5g
牛肉膏3g
葡萄糖1g
氯化钠5g
磷酸氢二钠1g
苯乙醇 2.5mL
无水甘氨酸10g
氯化锂0.5g
琼脂15g
蒸馏水1000mL
A5.2 制法
将上述成分加热搅拌混匀，调pH至7.2～7.4，分装，121℃15min高压灭菌，备用。
A6 SIM动力培养基
A6.1 成分
胰胨20g
多价胨6g
硫酸铁铵0.2g
硫代硫酸钠0.2g
琼脂 3.5g
蒸馏水1000mL
A6.2 制法
将上述各成分加热混匀，调pH7.2，分装小试管，高压灭菌121℃ 15min。