一般原则
6. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶 切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。
一般原则
7. 引物二级结构对PCR反应的影响。 尽可能少的引物二聚体。
常用的引物设计软件
Oligo 6 （引物评价）* Primer Premier （自动搜索）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*
一般原则
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%， 过高或过低都不利于引发反应。上下 游引物的GC含量不能相差太大。
不同的算法推荐45-55%或50-60%
一般原则
5. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由 能，该值反映了双链结构内部碱基对 的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值 较低（绝对值不超过9），而5’端和 中间∆G 值相对较高的引物。引物的 3’端的∆G 值过高，容易在错配位点 形成双链结构并引发DNA 聚合反应。 （能值越高越容易结合）
Primer Premier 5.0使用介绍(1) Load sequence Preimeruence
Sequence name
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a
protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
引物设计界面 First you can design the primer manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
Primer Premier 5.0 的使 用技巧简介
主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
简并引物设计
根据氨基酸序列来设计引物DNA引物 Premier Primer 5提供了8种生物遗传密
码使用的偏好选择
1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear） 2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion） 3、支原体（Mycoplasma） 4、植物线粒体（Plant Mitochondrion） 5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion） 6、一般标准（Standard） 7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion） 8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）
一般原则
引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp ，但不应大于38。 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物 长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存 在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个 长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点 只有1/400个. 较长的引物（28-35bp) 一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用 于产生一些突变位点
PCR引物设计及相关软件的应用超实用
主要内容
背景 PCR引物设计原则 常用PCR引物设计软件 Primer Premier 5.0 介绍 Oligo 6.22 介绍 在线Primer3 介绍
PCR
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体 外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率 高、快速、简便、重复性好、易自动化等突 出优点；能在一个试管内将所要研究的目的 基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万 乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可 从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增 出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
PCR引物设计
引物设计是PCR 技术中至关重要的一 环。使用不合适的PCR 引物容易导致 实验失败：表现为扩增出目的带之外 的多条带（如形成引物二聚体带）， 不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。 可以直接提交模板序列到特定网页， 得到设计好的引物，也可以在本地计 算机上运行引物设计专业软件。
一般原则
3，引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位 碱基在错配位置导致不同的扩增效率 ，末位碱基为A 的错配效率明显高于 其他3 个碱基，因此应当避免在引物 的3’端使用碱基A。另外，引物二聚 体或发夹结构也可能导致PCR 反应失 败。5’端序列对PCR 影响不太大， 因此常用来引进修饰位点或标记物。
Tm值的计算 一般的公式
Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 对于长一些的引物可用更为准确的 nearest-neighbor （Frier et al. (1986) ）
一般原则
1. 2. 引物序列在模板内应当没有相似 性较高，尤其是3’端相似性较高的 序列，否则容易导致错配。引物3’ 端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。
引物设计的原则
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚 体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体因素
如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部 稳定性(internal stability, 用∆G 值反映 )，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹 结构（duplex formation and hairpin）的 能值，在错配位点（false priming site） 的引发效率，引物及产物的GC 含量（ composition），等等。必要时还需对引物 进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进 突变等。