Tn5
实验原理
Tn5：发现于E.coli，序列全长5818bp。 核心序列：编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素)； 两个倒置的IS50：IS50R编码53KD的Tnp和48KD的转座阻遏蛋白
(Inh),两者使用同一阅读框，但启动子不同。IS50L的第1442碱基处存在一 个赭石突变，IS50具有19bp的倒置末端，二者有7个碱基不相同，是转座 酶(Tnp)的作用位点。
现代微生物学实验技术
马玉超
北京林业大学生物科学与技术学院
办公地点：生物楼117；电话：62336016； Email:myc0307@
实 验 内 容
♣ 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列
♣ 转座子随机突变及目的表型的筛选
♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导
♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性
实验结果
表 巴西固氮螺菌 Yu62 野生型及突变体的IAA产量 菌株(Strains) (OD600) (OD540) IAA浓度 (μg/ml)
ck(培养基) Sp7 1-1 1-2 1-3 1-4
●下次实验
大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导
实验材料
1. 菌株
E. coli S17-1/pPRL1063a; 巴西固氮螺菌sp7
2. 培养基及试剂
(1). 细菌丰富培养基
LB培养基 LD培养基
胰蛋白胨 (g) 10 10 酵母提取物 (g) 5 5 氯化钠 (g) 10 2.5 pH 7.0 6.8 固体培养基加入1.3% 琼脂粉，dH2O定容至1L，121℃灭菌20min
♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取
转座子随机突变及目的表型的筛选 李丽萍
实验目的
1.了解细菌常见转座子Tn5的结构及转座机理 2. 学习利用转座子进行随机插入突变的实验过程 3. 掌握双亲接合实验的原理及过程
实验原理
转座子：
转座因子或跳跃因子，它可以从遗传物质的一部分 跳跃到另一部分，从而引起遗传变异。
注意：事先准备好LD平板
第三天：
用液体LD培养基洗下菌泥，铺于同时含有Km、Ap、Nx的LD 平板上，30℃培养，筛选接合子。
第四天：
挑取接合子在含有上述三种抗生素的LD培养基平板上划线分 离，保证得到的为单菌落。
第五天：
挑单菌落分别接种于5ml MAZ培养基中30℃摇瓶培养（野生 菌对照）.
第六天：
(2).用于IAA摇瓶培养的培养基(MAZ培养基)
(3).抗生素
抗生素名称 氨苄青霉素 (Ap) 卡那霉素(Km) 萘啶酮酸(Nx) 贮存液配制方法 100 mg/ml 水溶液，-20℃ 100 mg/ml 水溶液，-20℃ 20 mg/ml 水溶液，-20℃ 50 μg/ml 使用浓度 E.coli A.brasilense 25 μg/ml 30-50 μg/ml 5 μg/ml
用比色法测定菌液中的IAA含量。 比色试剂：含12g/L FeCl3 的H2SO4 取1ml 测量OD600； 取1ml 菌液12000rpm 离心 5min后取上清与比色试剂等量混 合，摇匀后在暗处放置30 min，然后测OD540nm
注意安全
注：空白对照，未接菌的培养基与比色用试剂的混合液。
标准曲线
转座子的发现：
20世纪50年代初期，美国冷泉港实验室遗传育种学 家McClintock 通过对玉米籽粒色斑不稳定现象的研 究而发现转座现象，首次发现了能在基因组内不同 区域转移的控制成分。
实验原理
细菌转座子的类型：
插入序列 (Insertion sequence); 复合转座子 (Composite transposons); TnA 转座子家族 (TnA family); 可移动噬菌体 (Mu phage).
突变位点(Mutation site)
OE IS50L
P3 P4
IE kanr strr bleor
IE IS50R
OE
P1 (Tnp) P2 (Inh)
Tn5的转座机理
实验原理
实验原理
DNA sequencing
实验原理
非转移性质粒： 转移性质粒：能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能 带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移; 接合作用：质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接 接触才能进行.
3. 主要仪器
小型离ห้องสมุดไป่ตู้机
实验步骤
第一天：
中午12：30～13：30接种sp7 至5ml LD 液体培养基中，30℃ 振荡培养约20小时。 晚5：30，接种供体菌pRL1063a/E.coil S17-1 至5ml LB+Km 液体培养基中，37℃振荡培养约16小时。 第二天：
上午9：00，用同一个1.5 ml 离心管收集适量供体菌和受体菌。 12000rpm 离心30 sec，弃上清，用移液器将菌泥悬浮混匀后 移入LD平板中央，尽量减少气泡的产生。 30℃正置培养过夜。
受体菌，Ap Nx 巴西固氮螺菌Sp7 重组巴西固氮螺菌， Ap Nx Km
供体菌 S17-1 质粒pRL1063a,Km
实验原理
植物生长激素， 由植物根系细菌合成， 对植物的生长及一些 发育阶段的调控起关 键作用
A-B：吲哚乙酰胺途径； E-F-D：吲哚丙酮酸途径； C-D：色氨酸侧链途径
细菌中IAA合成的几种途径