1、当Fv/Fm比值在0.5左右时,说明在突变体中 PSll内部的电子传递受阻或者突变体中部分PSll功 能丧失的结果。这是由于Fo升高引起的。
2、当Fv/Fm比值高于0.6时，则认为PSll下游电子 传递链复合物(包括PSI和细胞色素b6/f等)受到影 响。
3、当突变体的Fv/Fm降低到0.7左右，说明在突变 体中Psll内部的电子传递没有受阻，而可能是PSll 以后的Cytb6f或PSI复合物发生突变的结果。
因为很多与光合作用相关的基因突变,会直接引 起叶片颜色的改变。叶色变异是比较常见的突 变性状,一般在苗期表达,但少数突变体直到发 育后期才发生叶色突变。由于基因突变往往是 直接或间接影响叶绿素的合成和降解,改变叶绿 素含量和叶绿素a/b的比值,所以叶色突变体也 多为叶绿素突变体。叶色突变体的分类主要从 苗期叶色来划分,如白化、黄
• 适当的选择压力应当是既能使突变体的优 势得到发挥,又能使野生型受到足够的压力 而不能表现。在筛选突变体之前,首先要设 计一系列的筛选浓度,以野生型完全不能生 长的浓度确定为筛选浓度。
根据高叶绿素荧光表型筛选突变体
• 其中高叶绿素荧光表型,作为光合电子传递链受损的标 志,广泛地应用于筛选光合组分功能缺失的突变体。在 正常的条件下,光化学反应与非光化学途径活性很高,荧 光的释放很低(约3一5%);相反,如果由于类囊体膜蛋白 复合体结构的改变等原因而造成的光合电子传递的受 阻,则所吸收的光能不能有效传递转变成化学能,便会以 热或高荧光的形式释放出来,使光受体从激发态回到它 的稳定态(基态),导致吸收的能量以红色荧光进行释放 的比例增加,这样我们便能在暗室中观察到与正常植株 所发出的暗红色荧光相比是亮红色的荧光,即产生高荧 光(hcf)的表型从而将突变体筛选出来。
• 叶绿素荧光成像系统对突变体进行筛选， 设定不同伪彩色参数挑选出Fo；Fm； Fv/Fm;NPQ变化的突变体。
室温状态下,暗适应后的突变体野生型各生 长时期植株用于分析。
• 过程： • 1、测量前，使植株暗适应至少30分钟； • 2、打开测量光(measuring light,650nm的脉冲测量红
下春化3天后种植。
诱变植株培养：
• 将经EMS诱变处理后的拟南芥种子(M1)播 种于用1 /4Hoagland营养液浸透的混有蛭石 的营养土中(营养土:蛭石=2:1, v/v),种植后 覆盖塑料薄膜以保持湿度。在温度18~22℃、 光照强度120μmol/m2s-1、光暗周期16h/8h 条件下培养,待种子成熟后分行采收种子 (M2代)。
• 植物叶片经过充分暗适应后,PSI和PSll均处于
还原状态，在650nm,光强为0.05o.1μmol/m2s的测量红光下，由于Psl主要吸收 远红光，Psll主要吸收红光，此时叶片电子传 递过程主要停留在PSll中，得到稳定的初始荧 光值FO。施加单饱和脉冲(3000μmol/m2 s for 0.8s)后，Psll暂时达到饱和，Psll的电子受体 QA被完全还原，叶绿素荧光产量由基态F(o) 上升到最大值F(m)。这可以决定PSll最大光化 学量子产量,Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm(Maximum quantum yield of PSll)，表明最大PSll光能转 化效率。在拟南芥野生型叶片中,常在0.8-0.84 之间。
以稳定，得到Ft，在激活光存在下打开单饱和光(a saturating flash of light,持续800ms,光强为 6000μmol/m2 s)脉冲一次，与此同时，测量光脉冲频 率变为20KHz，得最大荧光值Fm。 • 6、等曲线回落下来并达到稳定，关闭激活光，再关闭 测量光。记录Fo,比率(Fm一Fo）/Fm=Fv/Fm,光饱和曲 线等。
100mmol/L磷酸缓冲液配置：
• 1、准备100ml 1M K2HPO4和100ml 1M KH2PO4;
• 2、将70ml K2HPO4和20ml KH2PO4在烧 杯中混匀；
• 3、用KH2PO4将PH调到6.5； • 4、将1M的磷酸缓冲液稀释到100mmol/L。
突变体筛选
• 根据光合色素的改变来筛选叶色突变体
EMS诱变拟南芥
诱变方法： 称取250mg(约5000粒)野生型种子+25ml重蒸水 →50ml烧杯内搅拌30min→4℃下放置12h→30ml 100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)的100ml三角瓶中 →加入0.2%(v/v)的甲基磺酸乙酯(EMS)→封口后 放在水浴(25℃)振荡器上振荡12h→50ml蒸馏水 漂洗种子4次,每次15min→将漂洗好的种子置4℃
知识回顾 Knowledge Review
光，脉冲频率为1.6KHz,光强0.05μmol/m2 s)，得最小
荧光值Fo； • 3、得到稳定的初始荧光值Fo，施加0.8s的单饱和脉冲
光(3000μmol/m2 s); • 4、1.5分钟后，曲线基本稳定，打开激活白光(actinic
light，光强为40μmol/m2 s); • 5、7.5分钟时光合作用己达到稳定状态，曲线基本可
根据叶绿素荧光参数筛选突变体
• 以叶绿素荧光参数为指标,可以得到不同类型的 突变体,其中影响非光化学淬灭（NPQ)和Psll的 有效量子产率(Φll)是两种主要类型的突变体。
突变体筛选： 接种:拟南芥种子用10%次氯酸钠浸泡15分钟,其
间不时的振荡使灭菌充分,再用无菌水冲洗种子 3次以上,灭菌处理后的种子点播于含3%的蔗糖 的MS固体培养基(0.8%琼脂)上,接好的种子放 在4℃冰箱里春化2天。 培养:于22℃下,光强120μmol/m2sec(12h光照/12h 黑暗)的光照条件下培养15-20天之后进行筛选。