参考文献
1 韩贻仁 .分子细胞生物学 .第二版 .上海 :科学出版社 , P10 2 李楠 .激光扫描共聚焦显微术 .第一版 .北京 :人民军医出 版
社, P1 3 Storch W B.免疫荧光 基础 — 实验新 原理及 临床新 应用 .第 二
版.北京 :人民卫生出版社 , P15 (2002-04-29 收稿)
左 上 :经 Rhodamine 标记的 某抗体 ;
右上 :FITC 标记的某抗体 ; 左 下 :前 二幅 图 的 综 合图
(上海 第二医 科大学 组胚教研室赠)
图 7 共聚焦显微镜下 Cos 细胞某种膜某抗体蛋白分布图
2.3 动态观察 在同一样品平面上随时间进行连续扫描 , 就可
分析细胞结构 、内含 、和标记等动力学变化 。 目前在 这方面做得最多的是使用 LSCM 观察心肌或平滑肌 细胞内游离钙 、钠 、钾离子浓度或 pH 的动态变化 。
在光轴上共聚焦 , 以至透过标本一点的光线通过透 镜后 , 不能聚焦成一点 , 而是形成一个光斑 , 从而 使成像模糊不清 (图 2)。
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图 2 球差形成光学原理示意图 F— 理论焦点, F1 — 远轴光线焦点 , F2 — 近轴光线焦点, O — 光镜中心
所谓色差 , 是由于显微镜对不同颜色的光线具 有不同的折射率造成的 。 因为不同颜色的光具有不 同的波长 , 透镜类似于三棱镜 , 对不同颜色的光线 具有不同的折射率 。 所以光线透过透镜后 , 不同颜 色的光聚焦在不同点上 , 从而使成像模糊 , 而且像 的边缘尚带有色彩 (图 3)。
1 LSCM 的原理
1.1 普通光学显微镜的光学原理 普通光学显微镜的成像原理如图 1 所示 :
图 1 普通光镜成像原理示意图 F— 焦点, 左侧箭头代表物体, 右侧箭头代表物体, O — 光镜中心
作者单位 :山东中医药大学中医基础学院中心实验室 (250014) 作者简介 :赵启韬 (1970—), 女 , 讲师 。
【Key words】 Laser scan confocal microscope Image-analysis Immunfluorescence
0 前 言
近年来 , 激光共聚焦显微镜 (laser scan confocal microscope , LSCM)在医学和生物学研究方面的 应用越来越广泛 , 它成像清晰 、 精确 、 客观 , 大有 取代和淘汰传统的普通光学显微镜和荧光显微镜的 趋势 。因此 , 作为医学工作者 , 了解和应用这种仪 器亦是大势所趋 。
在一般人想 象中 , 似乎显微 镜的放大 倍数越
大 , 观察到的物体应该越清楚 。 然而事实不然 , 决
定显 微镜成 像清晰 度的因 素是 其分 辨力 (resolution)[ 1] 。分辨力是指显微镜能将近邻的两个质点分
辨清楚的能力 , 通常是用显微镜所能分辨清楚最近
的相邻两点间的距离来表示 , 可通过以下公式表示
LSCM 在不损伤细胞的前提下 , 对活组织 、 活 细胞进行观察和测量 , 这不仅省去了繁琐的样品前 期处理过程 (如脱水 、 脱蜡 、 染色等);而且观察 过的样品还可以继续用于其他的研究 。这种功能对
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北京生物医学工程
第 22 卷
于细胞培养 、 转 基因研究尤为 重要 。 这可以 说是 LSCM 最大的优势 (图 6)。
图 4 共聚焦技术光学原理示意图 (Zei ss 公司提供)
图 3 色差形成光学原理示意图 F— 理论焦点 , F1 —红光焦点 , F2 — 紫光焦点 , O — 光镜中心
1.2 激光共聚焦显微镜在技术上的改进 从基本原理上讲 , 共聚焦显微镜是一种现代化
的光学显微镜 , 它对普通光镜从技术上作了以下几 点改进[ 2] : 1.2.1 用激光做光源
由于综合利用了以上技术 。 可以说 LSCM 是显 微镜制作 技术 、 光电技 术 、 计算机技 术的完美结 合 , 是现代技术发展的必然产物 。
2 LSCM 在生物医学研究中的应用
目前 , 一台配置完备的 LSCM 在功能上已经完 全能够取代以往的任何一种光学显微镜 , 它相当于 多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合 , 如倒 置光学显微镜 、 紫外线显微镜 、 荧光显微镜 、 暗视 野显微镜 、 相差显微镜 (PH)、 微分干涉差显微镜 (DIC)等 , 因此被称为万能显微镜 , 通过它所得到 的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色 。 2.1 观察活细胞 、 活组织
D
=n
0.61 λ · sinα2
式中的 λ代表光源波长 (可见光的波长在 400
～ 700nm 之间), n =物镜与标本间介质的折射率 ,
α=镜口角 。 正常人眼的分辨力除以某台显微镜的
分辨力所得的值就是这台 显微镜的放大 倍数 , 即
N =D 人眼 D 显微镜 。正常人眼的分辨力为 2mm ,
它对普通光镜做了多方面的技术改进 :用激光做光源 并采用 了共聚焦 技术消 除了透 镜的色 差和球 差 ;运用点 扫
描技 术 , 使标 本上每一点的图像避免了相邻点的衍 射光和 散射光 的干扰 ;结 果用计 算机处 理 ;因而其 图像高 度
清晰且数字化 。激光共 聚焦显微镜不仅可以观察 活细胞 、 活组织的 动态代 谢过程 , 而且可 以获得三 维图像 , 与
2.4 数据 、 图像的数字化 用计算机代替了普通的照相机 , 得到的图像是
数字化的 , 可及时输出或长期储存 , 而且还可进一 步加工处理 。 2.5 定量测量
首先应用专一的荧光探针对样品进行染色 , 样 品的荧光强度和所测成分的含量呈正比 , 如果其余 条件固定 , 通过对比各组样品之间的荧光强度值 , 可得出特定成分的含量比 (图 8)。
其他的生物学技术相配合 , 几乎可定性 、 定量定位地检测组织细胞内的任何一种生化成分 。
关键词 激光共聚焦显微镜 图像分析 免疫荧光
中图分类号 R312
文献标识码 A
文章编号 1002-3208 (2003) 01-0052-03
Application of Laser Scan Confocal Microscope in Bio-Medical Fields ZHAO Qitao , MIAO J unying . The Central Laboratory of Traditional Chinese Medicine College , Shandong University of Traditional Chinese Medicine , Jinan 250014
根据理论计算, 光学显微镜的分辨力可以达到
0.2μm , 或者说放大倍数可以达到 光镜放大倍数也仅有几百倍 。
光学显微镜的实际分辨力要受到一些物理因素
和透镜质量的影响 , 主要是受球差和色差的影响 。
所谓球差 , 是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线
第 1期
激光共聚焦显微镜在生物 医学研究中的应用
左上 :经 Rhodamine 标 记的 死菌 ;
右 上 :经 FITC 标 记 的 活 菌;
左下 :前 二幅 图的综 合图 . (上海第 二医科 大学 组胚教研室提供)
图 8 共聚焦显微镜下雪链菌
3 结束语
通过上述介绍 , 共聚焦显微镜强大的功能已可 见一斑 。 与其他的生物学技术 (如免疫组化技术 、 原位杂交技术等)相配合 , 它的检测范围进一步扩 大 。目前市场上出售的荧光探针已近 2000 余种[ 3] , 这就使我们几乎可利用共聚焦显微镜定性 、 定量地 检测细胞内的任何一种生化成分 。因此共聚焦显微 镜越来越成为生物医学研究人员的得力助手 , 随着 时间的推移 , 相信它的应用会更加普及 。
图 6 共聚焦显微镜下培养大鼠细胞图
左上 左下
:经 Rhodamine 标记的某抗体 :透射光下细胞图
; 右 右上 下
:FITC 标记的某抗体 :前三幅图的综合图
2.2 生化成分精确定位观察 配合专用的分子探针 , 对于要检测的成分不仅
可以定位到细胞水平 , 还可以定位到亚细胞水平和 分子水平 (图 7)。
【Abstract】 Laser S can Confocal M icroscope (LSCM)is a modern opti cal mi croscope .It is a product that integrates microscope manufacturing technology , optical-electronic technology, and computer technology .Compared with normal microscope , there are a lot of improvement s.Because its light source is a laser tube, color aberration of lens and spheri cal aberration of lens were eliminated .The use of point scanning technology resulted in that , for every pixel of the image of the sample diffraction and dispersion of neighboring pixel was avoided .Results thus obtained were processed with computer, so the images were digital and very sharp .With the LSM , not only the dynamic metabolism process of live cells and tissues can be observed, but also three dimensional images can be obtained.Moreover, i n combination with other biological technologies , almost every biochemical i ngredient can be detected and measured in quantity and quality.