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分子生物学在医学研究中的应用


塞雷拉人类基因组计划
塞雷拉人类基因组计划,在国际人类基 因组计划启动八年后的1998年,美国科学 家克莱格· 凡特创办了一家名为塞雷拉基因 组(Celera Genomics)的私立公司,开展 独立的人类基因组计划。因为塞雷拉基因组 的竞争促使国际人类基因组计划不得不改进 其策略,进一步加速其工作进程,使得人类 基因组计划得以提前完成。 测序方法:霰弹枪测序法(鸟枪法)
6
Glu Val
A→T
基因突变的检测对遗传相关疾病的检测 及发病机理研究非常重要。
基因突变检测方法
目的基因PCR产物的限制性内切酶片段 长度多态性 (RFLP) 分析
随机扩增长度多态性(AFLP)分析
单链构象多态性(SSCP)分析
1~4、7~9:野生型基因片段;5、6:两例Val384Asp携 带者的样本,显示变异的SSCP带型
在此基础上再在该染色体区域使用覆 盖程度更高的标物作深入的连锁分析就可 将致病基因确定在较少的区域,这样再利 用物理图提供的该区域的染色体片段将基 因确定或克隆。
连锁不平衡分析的原理
来自同一祖先的致病突变基因,在经 历多代减数分裂后与致病基因连锁的标记 基因多次重组而逐渐与致病基因间趋于平 衡,离致病基因越远的标记,二者趋于平 衡的趋势越大,离致病基因越近的标记, 由于重组率低与疾病就处于不平衡即紧密 连锁的状态。
基因替换
将含选择性基因与含有突变的目的基因 一起克隆到酵母菌质粒载体上,经扩增后, 将上述基因从载体上用合适的酶切下来或与 质粒一起转化酵母菌二倍体,含有选择基因 的突变目的基因将通过同源重组或整合到酵 母菌的染色体中,通过细胞分裂及选择性培 养可获得含有基因突变的细胞株。可通过上 述类似的方法将目的基因置换或融合到人酵 母菌的染色体中。
将含有突变基因的Es细胞通过直接注射 入小鼠囊胚或与小鼠叠模胚共同培养使Es 细胞进入受体小鼠胚胎然后将这种囊胚移植 到假孕小鼠子宫让其发育。长成的小鼠为杂 合子代小鼠(heterozygote),这种小鼠靶基 因的一个等位基因是正常的,另一个基因则 发生了人为的改变。再通过回交选择出两个 拷贝都发生了变化的纯合基因小鼠。
目的基因PCR产物的限制性内切酶 片段长度多态性 (RFLP)、随机扩增长度 多态性(AFLP)、单链构象多态性(SSCP) 等结合DNA序列测定技术是分析基因突 变的有效方法。
等位基因:C/G,
杂合型
二. 基因敲除及替换技术
生物体内有些基因发生突变,其功能可 被其它成份替换而不导致重要生理功能异常 该生物体能够存活或发育,而有些基因突变 时可导致严重的生理功能异常使生物体死亡。 通过将目的基因从染色体中去除或破坏而 观察该基因的生理作用称为基因敲除(Knockout);通过将目的基因插入染色体中而观察 该基因的作用称为基因替换(Knock-in)。
1965年,霍利完成了第一个酵母丙氨酸 tRNA的核 苷酸全序列测定. 1966年,尼伦伯格,霍利, 科拉纳共同破译了全部 的遗传密码.
1972年,博伊等人发展了重组DNA技术 1975年,Sanger等人发明了快速的DNA序列测定 技术.
医学的概念及主要任务
医学是生命科学的重要组成部分,是在 人类祖先自我防护本能的基础上,通过长 期的劳动实践和抗病害斗争而形成和发展 起来的一门科学。 医学的主要任务是防治疾病、保障健康 和延年益寿。
一. PCR及基因突变检测技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)简称PCR。PCR是体外酶促合成 特异DNA片段的一种方法,具有特异性强、 灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不 仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析 等基础研究,还可用于疾病与病原体微生 物的诊断等。
人类划是人类为了探索自身的奥秘 所迈出的重要一步,是人类科学史上的又 一项伟大工程。截止到2005年,人类基因 组计划的测序工作已经基本完成(92%)。 今天,人类DNA序列已经存储在数据库中, 任何人都可以通过互联网下载。美国国家 生物技术信息中心和位于欧洲和日本的相 关组织储存着整个基因序列,其中包含已 知序列,假设基因和蛋白质。
医学研究的发展过程
细胞水平:19世纪的细胞 学和微生物学 分子水平:80年代的生物技术和分 子生物学 量子水平:21世纪后从微观水平逐步阐明生命 和疾病现象的本质
基因克隆、扩增、测序为基础的分子生物 学技术已广泛应用于基础医学,以及疾病的 发病机理、诊断及治疗。 PCR技术的出现使人们能在体外快速大量 的扩增目的DNA,并将此技术应用于病原微生 物及特点基因的诊断—基因诊断。 遗传突变致病基因的发现为阐明遗传病的 发病机理提供了条件,并为基因治疗提供了靶 点及方向。
如果在互联网上访问由人类基因组信息 而建立的各种数据库,可以查询到其他科 学家相关的文章,包括基因的DNA、cDNA 碱基顺序, 蛋白质立体结构、功能,多态 性,以及和人类其他基因之间的关系。也 可找到和小鼠、酵母、果蝇等对应基因的 进化关系,可能存在的突变及相关的信号 传导机制等。
1869年米歇尔首次从莱茵河鲑鱼精子中分离 到DNA
1879年弗莱明 发现了染色体
1902年萨顿提出了染色体遗传学说并认为基 因是染色体的一部分 1910年摩根证明了基因存在于染色体上
1944年艾弗里证实了DNA是构成染色体的大分 子. 1953年Watson 和Crick 发现了DNA的双螺旋结 构. 1958年M.Meselson和F.W.Stahl 提出了 DNA半保留复制模型.
某些基因突变会导致编码蛋白质结构异 常并最终致病。 异常血红蛋白病(abnormal hemoglobin): 由于珠蛋白基因突变,导致合成的珠蛋白肽 链的结构和功能异常导致的疾病。 异常血红蛋白病发病机制:单个碱基替 换、移码突变、整码突变、融合基因、终止 密码突变 、无义突变。
镰状细胞贫血
Beta chain
这样在该基因发生突变后,它与其周 围标记构成的单体型(haplotype)就会逐渐 被新的单体型所取代,保持不变的单体型 就越来越短。利用这种原理,只要建立该 疾病群体中患者与亲代的单体型,根据整 个单体型的改变就可以找到与致病基因有 关紧密连锁的标记物,从而将该基因定位。
四.人类基因组计划
人类基因组计划 (Human Genome Project, HGP)是一项规模宏大,跨国跨 学科的科学探索工程。其宗旨在于测定组 成人类染色体(指单倍体)中所包含的30 亿个碱基对组成的核苷酸序列,从而绘制 人类基因组图谱,并且辨识其载有的基因 及其序列,达到破译人类遗传信息的最终 目的。测序方法:分级霰弹枪测序法
分子生物学技术的发展促进了该技 术在生物学、细胞生物学、医学等领域 的渗透与融合,反过来分子生物学技术 与其他学科的结合又产生了新的分子生
物学技术。
后面的同学,掌声在哪里~
分子生物学在医学研究中的应用
PCR及基因突变检测技术 基因敲除(Knock out)及替换(Knock in)技术 遗传病相关基因的研究 人类基因组计划 基因芯片技术 转基因动物技术 动物克隆技术 从鼠源性到人源性抗体 利用酵母菌双杂合系统确定相互作用的蛋白质
事实上,在人类基因组计划完成之 前,它的潜在使用价值就已经表现出 来。大量的企业,例如巨数遗传公司 (Myriad Genetics)开始提供价格适 宜,而且容易使用的基因测试,其声 称可以预测包括乳腺癌、凝血、纤维 性囊肿、肝脏疾病在内的多种疾病。
人类基因组计划对许多生物学 研究领域有切实的帮助。例如,当 科研人员研究一种癌症时,通过人 类基因组计划所提供的信息,可能 会找到某个或某些相关基因。
在遗传病相关基因定位领域常用的方 法有受孕同胞对法(ASP法),受孕家系成 员法(APN法),连锁分析法与连锁不平衡 分析法等。 连锁分析与连锁不平衡分析这两大基 本原理是所有这些方法的基础。
连锁分析的基本原理
在家系中,位于同一条染色体上的两个位 点(致病基因与遗传标记)在减数分裂的过程 中会发生交换与重组。重组率越高,两个位 点在一起传给后代的机会就越少,通过对覆 盖密度适当的遗传图中遗传标记物(marker) 在家系中进行分型(genotyping),以此找到 与致病基因紧密连锁的某一标记物,从而确 定该基因在染色体上的粗略位置。
分子生物学在医学研 究中的应用
临床医学研究中心
分子生物学概念及研究内容
分子生物学是从分子水平上研究生物大分 子的结构与功能,从而阐明生命现象本质 的科学。
研究的主要内容为核酸(DNA,RNA)和 蛋白质。
分子生物学的形成过程
1865年达尔文《物种起源》:性状可遗传
1865年孟德尔 遗传性状的单位称为基因
基因敲除技术的应用
1.基因敲除可用于建立人类疾病的转基因 动物模型,为医学研究提供材料。 1992年成功建立了囊性纤维化病(CF) 的致病基因(CFTR)基因敲除的CF小鼠模 型,为CF基因治疗提供了很好的动物模 型,得以顺利通过了基因治疗的动物试验, 于1993年开始临床试验并获得成功。 2.基因敲除可用于异种器官移植。通过将 引起排斥反应的基因敲除,为动物成为人 体器官的有效供体提供了可能。
3.基因敲除可用于治疗遗传病等,包括去除多 余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗 目的。
4.基因敲除技术可用于免疫学。同异源器官移 植相似,如果将动物免疫分子基因敲除,换 以人的相应基因,将产生人的抗体,从而解 决人源抗体的生产问题。
5.基因敲除技术还可用于改造生物,培育新的 生物品种。
三. 遗传病相关基因的研究
人类基因组计划的应用
破译人类遗传信息,将对生物学,医 学,乃至整个生命科学产生无法估量的深 远影响。目前基因组信息的注释工作仍然 处于初级阶段。随着将来对基因组的理解 更加深入,新的知识会使医学和生物技术 领域发展更为迅速。
人类基因组计划为疾病的基因诊断和 基因治疗奠定了基础,推动了亨廷顿舞 蹈病、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批 单基因遗传病致病基因的发现。目前对 于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精 神类疾病(老年性痴呆、精神分裂症)、 自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾 病基因研究的重点。
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