《福建畜牧兽医》#$$! 年第 #" 卷增刊
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单克隆抗体与免疫荧光染色技术
刘健宏 ! 王 标 # 庄向生 ! 王长兵 ! 周伦江 ! 刘玉涛 !
! 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 "%$$!" # 福建省农业厅农业执法总队 "%$$$!
自从 &’()* 和 +,)-./,0 于 !12% 年首创杂交瘤技术 以来，单克隆抗体已应用于免疫学、生理生化、药理学、 组织学、肿瘤学、微生物学等不同的学科，其应用之广、 发展之快，促使医学、生物学领域起着巨大的变革。单 克隆抗体是利用细胞融合技术，在体外大量培养融合 细胞，由融合细胞产生大量的抗体。由于单克隆抗体只 识别某一特定的抗原决定簇，所以它具有特异性强、成 分均一、灵敏度高、产量大、容易标准化生产等优点而 明显优于多克隆抗体。目前世界上己建立的单克隆抗 体品种数以万计，其中数千种已经上市。
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个试验期间将细胞保持在 "7 或加叠氮钠，可将这些过 程减少到最小限度。由于不能改变温度以适应不同亲
和性抗体的需要，可能不得不改变温育时间。对于大多
数抗体来说，"7 温育 %$9:; 是适宜的，但在这样的条件 下，低亲和性的抗体可能达不到平衡，因而需要更长的
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定、定位和示踪各种抗原或抗体成分。所以对标本的基 本要求是抗原的形态变化尽可能地小，不溶解或不变 性，原有位置不扩散或不移位。因此，对标本的处理一 般速度要快、温度要低，恒冷切片和涂片较为理想。此 外，抗体溶液的 -. 和反应温度越低，孵育的时间越长， 一般 %47 时需要 #3 8 1$9:;。若要作细致观察或者当天 不能进行染色标本的观察，可在 37 中过夜，但染色标 本最好是当天观察。 #2 ! 抗体 与多克隆抗体（即 常规血清）比较，单抗具有理化性质的一致性。就是这 种单抗的均一性，才体现出其应用价值，但是也存在不 利的方面。那就是：在标记反应过程中（包括纯化过 程），单抗的失活可能性远大于多抗的失活可能性。单 抗愈纯，愈易失活。均一的理化性质，就必然引起标记 的均一性。由于抗体与 /<=> 的结合势必引起抗体结构 的改变，特别是当单抗多变区（属 ?.# 端的游离氨基） 的结合，就显然影响到抗体抗原的反应，甚至使抗体完 全失活。比如 &’( @ %$ @ #（伪狂犬单抗）的标记过程 中，腹水纯化液的 </A 滴度达标记的 / 0 &（/ 0 & 值反映 荧光抗体的光学敏感性，其值过高，则非特异性染色将 显著增强；其值过低，则标记效率很低）比为 ! 8 % 时仍 然无活性，说明这种单抗的标记，严重损坏抗体的活 性。此外，单抗在 -. 1、4、5 条件下活性稳定，单抗愈 纯，愈易受酸碱的影响。
来，这就是筛选过程。由于每一个免疫淋巴细胞只能对 单一的抗原决定基产生特异性抗体，因此将筛选出的 融合细胞通过克隆化，使其集落生长成为单克隆细胞 系，就能产生大量单一的高纯度抗体，这种抗体就称为 “单克隆抗体”。 !5 # 荧光是染料吸收一种波长的光线，发出更大波长 的光线的物理学过程。处于基态的荧光色素受到紫外 线或兰紫外线光的照射而吸收足够的能量，而使色素 外层电子处于激发态。这种激发态电子给无辐射跃迁 到第一能级后则随着进一步的辐射跃迁而回落到基 态。在这辐射跃迁的同时释放能量，以可见光的辐射形 式释放，这就是荧光。其特征能量（较激发光而言）小而 波长长。这是由于部分能量以无辐射形式消耗的缘故， 而波长则与能量成反比。
免疫荧光技术又称为荧光抗体染色方法，它是将 血清学方法和显微镜示踪方法结合起来的一种技术。 这种技术是 3’’0- 等于 !14# 年首先建立的，在医学和 生物学研究工作中的应用将近 %$ 多年。荧光抗体法是 将特异性抗原多次注入动物体，使之产生抗体，将免疫 球蛋白从血清中分离出，用荧光色素标记，制成荧光标 记抗体溶液，以该溶液作为特异性试剂，浸染含有特异 性抗原（或抗体）的标本，借异抗原抗体的特异性，于抗 原或生物学染色方法有较高的特异性和敏感性。由于 免疫化学技术的进展和普及，荧光抗体染色法的应用 范围也不断扩大。对病原微生物的鉴定、血清抗体的检 测、特别是自身免疫病的研究、肿瘤免疫与诊断以及免 疫球蛋白的代谢研究均有其优越性。
抗体（免疫球蛋白）可以与荧光色素相结合，而不 失其抗体的免疫活性，与荧光色素相结合的抗体称为 荧光抗体。
利用荧光检测抗体的结合有两种不同的方法。直 接免疫荧光采用已直接以荧光染料标记的抗体；而间 接免疫荧光测定则是先将未标记的抗体与细胞反应， 然后再用荧光染料标记的抗抗体检测这种结合的抗 体。抗抗体通常称为第二抗体，是以用于生产单克隆抗 体动物的免疫球蛋白免疫异种动物制备的。当用小鼠 单克隆抗体进行间接免疫荧光测定时，第二抗体可以 是兔抗小鼠免疫球蛋白或山羊抗小鼠免疫球蛋白。
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$&’( @ %$ @ # 单抗亚级类属 *#+。-B 值约为 % 8 "2 3。在 碱性条件下最易失活，而且，大部分的—?.# 呈未质子化状 态，所以在中性偏酸的环境下照样进行加成反应。
% 非特异性染色 非特异性染色主要由于过度标记 所引起的，/<=> 过多的结合，造成抗体结构的改变，增 加了空间位阻，而且，/<=> 带负电荷，而病毒的核酸蛋 白多为碱性，在染色过程的 -. 均为中性而带正电荷， 进而造成静电引力的增加而出现非特异性的吸附。对
另外，必须采用饱和浓度的抗体，以便使荧光量受 抗原密度限制，而不受单克隆抗体或第二抗体浓度的 限制。通过预滴定几个稀释度的每一单克隆抗体或第 二抗体（以肉眼或流动式细胞计数器读数）确定抗体的 最适稀释度。当一个稀释度呈现出比前一个稀释度弱 的荧光时，抗体便不再处于饱和状态。为了防止该法固 有的波动，常规使用的浓度至少应保证在 # 倍稀释度 时荧光强度亦不致减弱。高浓度的抗体（如腹水）有时 呈现出前带，这一术语用于高浓度的抗体产生阴性反 应，而稀释的抗体呈现阳性反应时。在进行免疫荧光测 定中，由于有足够的未结合的单克隆抗体与溶液中的 标记物反应，从而阻断了标记物于结合与细胞的抗体 反应，可能会产生前带。在这种情况下必需洗涤 # 8 % 次。前带可因更复杂的原因而产生，但在免疫荧光测定 中不常见。 #2 # 温育时间和温度 正像大多数结合—解离平衡 一样，低温有助于结合，而高温有利于解离。然而在较 高温度下更迅速地达到平衡。因此，获得最大结合的良 好方法是先在 %47 温育，然后将温度降至 "7 。然而，另 一个对温度选择有影响的因素是抗体诱导的膜表面上 的抗原移位，这种移位的形式多种多样，如抗原斑片、 抗原盖帽、抗原的细胞摄粒作用及抗原脱落，最终可能 是抗原丢失（抗原调整），显然，这是应当避免的。在整
对于大多数用途来说，间接免疫荧光与直接免疫 荧光相比具有许多优点，尤其是仅用一种标记的第二 抗体即可检测一系列小鼠单克隆抗体。间接法更为敏 感，因为增加了被结合分子的数量。但在某些特殊场合 下，例如在双标志分析或第二抗体可能与靶细胞上的 抗原交叉反应时，则宁可采用直接免疫荧光法。 # 主要影响因素 免疫荧光染色方法主要是检查、鉴
异硫氰酸荧光素（=><3）是目前最为广泛应用的荧 光素。在碱性条件下，=><3 分子上的异硫氰基—? @ 3 @ A 能与抗体蛋白分子中的游离氨基（主要是赖氨酸 的—?:# 和少量的末端氨基）经碳酰胺化而形成硫碳氨 基键，结合为荧光标记抗体蛋白。! 个分子的 >B9 有 CD 个赖氨酸，但一般最多只能标记 !% E #$ 个。因为只有未 质子化的自由氨基才能与 =><3 起加成反应。在抗体侧 链游离氨基有赖氨酸的—?:#，谷氨酸的胍基，杂环氨 基酸———组氨酸，脯氨酸和色氨酸。其中杂环氨基酸不 易 与 =><3 反 应 ， 而 谷 氨 酸 的 胍 基 解 离 常 数 （F& 为 !#5 4C）较赖氨酸的—?:# 为小（F& 为 !$5 %"），所以质 子化的程度较赖氨酸为高，进而不易与 =><3 反应。 在偏碱性环境条件下赖氨酸之氨基部分未质子化，呈 G ?:# 状态而易于进行反应。
为了使单克隆抗体所要认识的目标变成可见的诊 断目标，那就必须通过把放射性物质、荧光素或酶分子 引入抗体等化学修饰手段来达到目的。下面就对单克 隆抗体和免疫荧光染色技术的原理、影响因素等方面 进行探讨。 ! 基本原理 !5 ! 免疫动物脾脏的淋巴细胞即 6 淋巴细胞能够产生特异性抗体，含有为抗免疫原抗体 编码的基因，但在体外培养条件下生存时间极短。而单 个骨髓瘤细胞系虽可在体外长期培养生长，含有提供 无限繁殖和分泌免疫球蛋白能力的基因，但其产生的 抗体却不具有分泌特异性免疫球蛋白的能力。将这两 类细胞融合而产生的杂交瘤细胞，一方面具有骨髓瘤 细胞无限生长的能力，另一方面又继承了免疫淋巴细 胞的功能，携带特异信息，从而大量合成特异性抗体。 由于细胞融合时，在融合剂聚乙二醇（789）的作用下， 只有少数细胞融合而形成杂交瘤细胞，因此必须通过 选择性培养基（:;<）将大量繁殖的未融合细胞分离出
于单抗而言，过度标记物宁可弃之不用。因为实验表明
离子交换层析的流出物之 / 0 & 比变化不大，这也说明 单抗的理化一致性。
综上所述，我们可以看到单克隆抗体荧光标记技
术将成为病毒诊断方面最为快速和准确的方法之一。
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