细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3.PBS洗净:3min＊34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2＊5min6.羊血清封闭：３７度，２０分钟７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时８.４度PBS洗净，３min＊５次９.二抗３７度小于一小时１０.３７度PBS洗净，３＊５min凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)（二）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
附:1. DPBS (×10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNa２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４ 2g2. 洗涤液DPBS 900mlFCS 50ml (终浓度5％)4％NaN３50ml (终浓度0.2％)3. 固定液DPBS 1000ml葡萄糖20g (终浓度2％)甲醛10mlNaN３0.2g (终浓度0.02％)4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
附:1. D PBS (×10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNa２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４ 2g2. 洗涤液DPBS 900mlFCS 50ml (终浓度5％)4％NaN３50ml (终浓度0.2％)3. 固定液DPBS 1000ml葡萄糖20g (终浓度2％)甲醛10mlNaN３0.2g (终浓度0.02％)严重同意楼上的讲解。
我是做流式细胞分析的间接荧光，图简单加一抗后只洗涤一次，二抗后没有洗涤，就直接加另外一个抗体，结果做了好多次就是呈阴性反应！排除了好久才多洗涤了两次，结果很是令人满意。
我想请问楼上：NaN３哪里有卖？谢谢！我找过，发现它是一种化学工业产品，成桶成桶的卖，而且有剧毒啊！是不是不是同一种东东？我做的是zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95％－100％时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4％的甲醛室温固定20－30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2％Triton X－100透化2－5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗（用1％BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗（用1％BSA稀释）30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95％甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。
2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
我要做的是occludin，可是效果不是很好，可以用甲醇固定吗，和甲醛比那个合适各位同仁:我现在急于做人乳腺癌细胞MCF-7的免疫荧光实验，目的是测凋亡时，基因bax、bcl-2的蛋白表达变化。
不知道怎么选一抗和二抗试剂盒。
请高手指教。
万分感谢！能发一个邮件更好，再一次感谢！我的E-mail：********************.cn抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可.之后片子可保留更长时间bu不是原创我是做悬浮细胞THP-1的，是人单核细胞系，主要问题是悬浮细胞在洗涤以及孵育次数多了会越洗越少，请问各位怎么洗法细胞不会变少。
（离心转速比较重要，还有有人说离心后上清不用移液器吸，直接倒比较好，我也试过，可还是越来越少）顶一下我也遇到了同样的问题，不知那位高人能够指点迷津？另悬浮培养的细胞是不是也需要先固定在做后面的处理？我听说悬浮细胞是最后一步才固定，我的实验步骤中太多道听途说啊，没办法，找不到完全相同的文献，很多protocol都是针对贴壁细胞。
不是悬浮细胞，是检测的蛋白在细胞膜上的是最后一步固定MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。
还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
也可以用DMSO来溶解。
MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
一、步骤1、接种细胞用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。
2、培养细胞同一般培养条件，培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。
3、呈色培养3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
4、比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
二、注意事项1、选择适当得细胞接种浓度。
2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。
在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。
其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。
MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50%的时候药物的浓度。
把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50%抑制率时候的药品浓度，就是IC50。
要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可!三、举例各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。
代入计算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025有一个公式可供参考;lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm：lg 最大剂量I：lg(最大剂量/相临剂量)P：阳性反应率之和Pm：最大阳性反应率Pn：最小阳性反应率抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率例：用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。