酸乳的制作和乳酸菌的分离培养
酸乳的制作和乳酸菌的分离培养
实验目的
▪ 1、学习酸乳的制作原理和方法，可以自制发酵酸乳； ▪ 2、掌握微生物实验中的几项基本操作技术：倍比稀释、平板涂布和
菌落计数。了解平板菌落计数法在微生物活体计数中的意义。 ▪ 3、学习通过平板划线分离得到单菌落的方法，熟练掌握平板划线分
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第II部分
平板涂布菌落计数法
实验原理
▪ 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞， 取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可 见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍 数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
▪ 但由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自 样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平 板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu ：colony-forming units）， 而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
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倍比稀释原理
Plate 0.2-ml samples
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实验器材
• 试管、温箱、
培养皿、涂
仪 器
布棒、 • 移液器、枪
头、酒精灯、
培 • RSP平板 养 • RSP斜面 基
材 • 自制酸乳 料
• 记号笔等
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实验步骤
1、乳酸菌培养基的制备，每人灭菌如下物品：
乳糖牛肉膏蛋白胨RSP(1L) ：
乳糖 5g， 牛肉膏 5g， 酵母粉 5g， 蛋白胨10g， 葡萄糖10g， NaCl 5g， 琼脂粉18g，
在42℃的条件下培养8-9h，依靠微生物的协同发酵作用发生一系列 生化反应，冷藏过夜后即成酸乳。
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酸乳的制作
▪ 仪器：酸奶杯，恒温培养箱，冰箱 ▪ 材料：
鲜乳，乳酸菌粉、白砂糖包、酸奶杯、搅拌棒
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1. 加样及接种
湿抹布擦拭桌面，在火焰旁，酸奶杯中加入乳酸菌粉0.1g（约1角硬币 大小面积菌粉，或1/5高度的酸乳）、白砂糖1包、鲜乳100ml，搅拌混合 均匀，封口。
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5、涂布
▪ 取9块乳糖牛肉膏蛋白胨平板（RSP），每3块一组，分别在皿底边缘 以10-5、10-6、10-7做标记。
用移液器200ul相应浓度的菌悬液，左手将皿盖在火焰旁打开一缝，然
后将菌液滴在平板中央。
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5、涂布
右手持金属涂棒，将其在酒精中蘸一下后接触火焰，待火焰熄灭后即完成涂棒的 灭菌。涂布前，先将涂棒在皿盖内侧的冷凝水中冷却，然后将平板中央的菌悬液 分散开，最后，将涂棒紧贴于平皿边缘，左手以同方向转动平皿，使菌液均匀地 分散在培养基上。静置5-10min，使菌液完全吸附到培养基内。
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酸乳的营养价值
▪ 酸乳能在肠道内抑制有害微生物的生长，经常饮用酸乳，其中含有 的活性乳酸菌在肠道内繁殖，产生的乳酸能抑制其他有害微生物的生 长，避免人体产生毒素，保证人体健康。
▪ 乳酸菌在人体肠道的发酵过程中促进了酒精发酵，其产物能使人体消 化腺机能增强，促进食欲，并能增加肠蠕动和机体的物质代谢。
每人做2杯， 加糖、不加糖 写好班级姓名
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2. 发酵与冷藏
将已接种的鲜乳放入42℃ 温箱中发酵培养8-9h；
转入4 ℃冰箱冷藏过夜 后，即成可食用的酸乳。
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酸乳品质的鉴别
▪ 色泽鉴别：色泽均匀一致，呈乳白色或稍带微黄色。 ▪ 组织状态鉴别 ：凝乳均匀细腻，无气泡，允许有少量黄色脂膜和少
量乳清。 ▪ 气味鉴别 ：有清香、纯正的酸奶气味。 ▪ 滋味鉴别 ：有纯正的酸牛奶味，酸甜适口。
▪ 有些乳酸链球菌能分泌一种抗菌素，抑制乳房炎、白喉、肺炎、结核 等病原体，此外，某些乳酸菌还能形成对炎症有特殊作用的B族维生 素。
▪ 因此，酸乳不仅是一种具有很高吸收率和消化率的乳制品，而且还
是一种对某些疾病具有治疗效果的乳制品。
Hale Waihona Puke 7自制酸乳的原理市售的酸乳中含有活性的保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌等，从中取 样后在无菌条件下接种到鲜乳中，
倒平板，每人9块RSP。
灌制试管
灭菌后， 斜面摆放
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3、标记
▪ 取已灭菌的内有9ml生理盐水的小试管6-7支，在试管壁上依次用10-110-7做标记。
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4、倍比稀释
▪ 在火焰旁，吸取1ml酸乳原液沿管壁加入第一支管中，然后换第二只 1ml枪头将此悬液吹吸混匀，即成1/10稀释液。
▪ 从此悬液中吸取1ml加入第二支试管中，换取第三只枪头吹吸混匀， 制成1/100的稀释液。以此类推，将酸乳稀释到原始浓度的1/107(千万 分之一)。
涂棒灭菌
冷却涂棒
均匀涂布
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6、37℃温箱内培养2d，观察实验结果。
10-4
10-5
10-6
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乳酸菌菌落形态
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7、计数
▪ 固体样品以cfu/g为单位，液体以cfu/ml为单位； ▪ 若只有一个稀释度在30-300之间，每毫升中菌落形成单位cfu/ml ＝
同一稀释度的平均菌落数×稀释倍数×5
▪ 指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总 称。
▪ 兼具需氧和厌氧的性能。 ▪ 乳酸菌不仅可以提高食品营养价值，改善风味，保藏性，而且能够调
节机体胃肠道正常菌群、提高食物消化率，降低血清胆固醇，抑制肠 道内腐败菌生长，对机体的营养状态、生理功能等产生作用。 ▪ 这类细菌通称益生菌；
离技术等操作。 ▪ 4、学习厌氧培养技术与斜面接种方法，观察微生物在斜面上的生长
特征。
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实验内容
▪ 第I部分：酸乳的制作 ▪ 第II部分：平板菌落计数法 ▪ 第III部分：平板划线分离与斜面接种 ▪ 第IV部分：厌氧培养与斜面接种技术
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第I部分
酸乳的制作
乳酸菌lactic acid bacteria，LAB
250ml RSP培养基
×1瓶
约4.5ml斜面RSP培养基 ×2支
约4.5ml液体RSP培养基 ×2支
0.85％NaCl 9ml （自配）×6-8（小试管）
9cm培养皿
×12（1包）
蓝色枪头1ml
×1 盒
黄色枪头 200ul
×1 盒
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2、制备斜面、平板
待灭菌的试管培养基冷至50℃左 右(以防斜面上冷凝水太多)，将 试管口端搁在玻棒或其他合适 高度的器具上，搁置的斜面长 度以不超过试管总长的一半为 宜。