酸奶制作及乳酸菌的分离计数
一、实验目的
1、学习自制酸奶的方法。
2、熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法。
3、掌握用浇注平板法分离微生物纯种。
4、了解简便、快速厌氧菌菌落计数法的基本原理。
5、学习用简便、快速厌氧菌菌落计数法对乳酸菌进行活菌计数。
二、实验原理
酸奶又称酸乳，是以牛奶为主要原料，经乳酸菌发酵而制成的一种营养丰富、风味独特、国际流行的保健饮料。
酸奶发酵中的主要生物化学变化是：乳酸菌将牛奶中的乳糖发酵成乳酸使其pH降至酪蛋白等电点附件从而使牛奶形成凝固状；其次，乳酸菌还会触使部分酪蛋白降解、形成乳酸钙和产生一些脂肪、乙醛、双乙酰和定二酮等风味物质。
酸奶发酵过程通常是由双菌或多菌的混合培养实现的。
其中的杆菌先分解酪蛋白为氨基酸和小肽，由此促进球菌的生长，而球菌产生的甲酸又刺激了杆菌产生大量的乳酸和部分乙醛，由此链球菌还产生了双乙酰这类风味的物质，因此，达到了稳定状态的混合发酵。
根据高层半固体培养基具有良好厌氧性能的原理，我们设计了一种适用于乳酸菌等不产气的厌氧菌进行简便快速菌落计数的方法。
此法把稀释（在半固体培养基凝固前）和（在半固体培养基凝固后）集中在同一支试管中内，以不易透氧、装有高层半固体培养基的试管代替常规的培养皿平板进行菌落计数，从而使活菌计数操作简化成“试样分散----逐级稀释+常规培养---菌落计数”3步，而传统的方法则需“试样分散----逐级稀释---涂布或浇注平板---厌氧培养---菌落计数”5步。
因此，本法不仅有简化操作步骤的优点，还有省略专用厌氧培养装置、缩短培养时间以及节约试剂和材料等优点。
三、实验器材
1、菌种：德氏乳杆菌保加利亚亚种、唾液链球菌嗜热亚菌（可从品牌酸奶商品中自行
分离）
2、培养基：（1）LAB半固体培养基100ml
（2）MRS琼脂培养基200ml
(3)MRS液体培养基10ml
3、材料：优质全脂牛奶或奶粉（内含脂肪28%，蛋白石27%，乳糖37%，矿物质6%，水分2%），蔗糖：市售优质酸奶（1瓶）
4、器皿：锥形瓶（3个）、空试管（14支）、无菌移液管（1ml*15根，10ml*2根）、培养皿（6套）、涂布棒、量筒、酒精灯、恒温水浴锅，恒温箱，冰箱
四、实验步骤
1、实验的准备
（1）配制LAB半固体培养基100ml，MRS琼脂培养基200ml，MRS液体培养基10ml
（2）用量筒各量取自来水225ml至2锥形瓶中，用移液管移取4.5ml至4支试管中
（3）将培养基进行分装，用无菌移液管吸取9mlLAB半固体培养至6支试管中，用无菌移液管吸取5mlMRS 液体培养基至2根试管中，用无菌移液管吸取10mlMRS琼脂培养基至2根试管中制作两个斜面
（4）用报纸进行包扎试管，移液管，锥形瓶，培养皿，然后放入灭菌锅进行灭菌
2、酸奶的制作
（1）配奶：在牛奶中添加6%~10%蔗糖后搅匀。
（2）消毒：将酸奶原料置于85~90℃下消毒15min
（3）冷却：将消毒后的牛奶冷却至45℃左右
（4）接种：按5%~10%（V/V）比例将市售优质酸奶作菌种接入冷却牛奶中，充分搅匀
（5）装瓶：将上述牛奶按无菌操作灌入无菌三角瓶中，每瓶灌装量约为250g（使液面距瓶口1.5cm）（6）保温：将接种后的牛奶置于40~42℃的恒温箱中保温3~4h（具体时间视凝乳速度而定）
（7）后熟：已形成凝胶状态的酸奶在4℃左右的低温下保持12~24h，以使其后熟（后发酵）
（8）品味：评定酸乳质量有理化指标和微生物学指标两类。
品尝时有良好口感和风味，同时观察产品的外观，包括凝块状态、色泽洁白度、表层光洁度、无气泡和具有悦人香味等。
相反，若品尝时发现有异味时则说明发酵中污染了杂菌
3、乳酸菌的分离
（1）培养皿编号：取6只培养皿，分别编上10-4、10-5和10-63种稀释度（各两皿）
（2）稀释菌样：吸取25ml酸奶至一锥形瓶中，摇匀，再吸取25ml至另一锥形瓶中，取4支试管，依次编号10-3-10-6，在各管中分别加入无菌水4.5ml，然后逐级稀释
（3）吸取菌液：从10-4、10-5和10-6各管中，分别吸出0.2ml菌液加至相应编号的无菌培养皿中
（4）浇培养基：向各培养皿中分别倒入充分融化并冷却至45℃左右的LAB半固体培养基，并立即将菌液和培养基充分均匀，并立即放平，待凝
（5）恒温培养：将含菌平板倒置，在37℃恒温培养箱中培养24h左右
（6）挑单菌落：用灭菌后的接种环挑取单菌落至试管斜面，恒温培养
4、乳酸菌的计数
（1）准备试样：吸取酸奶1ml
（2）制高层试管：将固体培养基加热、融化，冷却至50℃左右，用10ml移液管在每支无菌试管中灌9ml，然后放在45℃水浴中保温待用。
（3）梯度稀释：按常规方法用无菌移液管吸取1ml含菌试样至9ml半固体培养基试管中，然后使其充分均匀，然后吸1ml至下一支试管中，如此逐级稀释10-6为止
（4）恒温培养：待稀释均匀后，各稀释度的试管垂直放在试管架上，置37℃恒温培养24h左右
（5）观察与计数：经培养后，在高层半固体培养基试管内形成许多透镜状或近球状的菌落数出各试管中形成的菌落数目
（6）镜检：制片镜检观察
五、注意事项
（1）必须选用不含抗生素的牛奶作为发酵原料，否则将抑制乳酸菌的生长
（2）牛奶加热的温度如过高，会杀死酸奶中的乳酸菌造成发酵失败，如温度过低又会造成发酵缓慢，以摸着不烫手为度。
（3）在浇注平板法中，注入培养基不能太热，否则会烫死微生物
（4）挑取单菌落时应注意选取分散、孤立并具有典型特征的菌落，以尽快获得纯种
（5）乳酸菌计数时所用的稀释试管与菌落计数试管是同一试管，所以计数时应切记两点：一是因每管在混匀后都要吸出1ml，最后仅有的9ml培养基，所以长出的菌落数均应乘以10/9才能表示其实际菌落数。
二是最后稀释度试管中长出的菌落数，实为前一稀释度每毫升所含的菌落数，所以在乘稀释倍数时切忌出错。
六、实验结果
这是浓度从10-1-10-6LAB半固体培养基培养的乳酸菌
MRS固体培养基有淡白色的菌落产生，菌落较分散;MRS斜面有一层菌落覆盖，表面湿润，小而隆起乳酸杆菌菌体杆状，单个或成链，有时成丝状、产生假分枝。
六、实验分析
酸奶视觉质地：凝块状态、厚度、拉丝感一般、色泽洁白、表层光滑，无气泡和具有悦人香味，口腔触觉质地：爽滑，黏度与细腻度略差，风味：酸甜比不协调，甜度差，略有点苦，具有牛奶的自然香气，回味一般。
由于制作酸奶时没有考虑太多，就随便放了一点糖，由于糖放的少，让制作出来的酸奶口味不佳，我制备出来的酸奶，结果不是很令人满意，但我还是很喜欢，毕竟是我亲手制取出来的物品。
这种乳酸菌的计数方法虽然很简便快速，但是在这种稀释度下，我们在LAB半固体培养基培养出来的乳酸菌数量依然很大，在试管中无法准确地得出乳酸菌的数量，而且用LAB半固体培养基稀释时温度很难准确把握，刚移取前两个梯度的试管，后面几个梯度的试管就凝固啦，虽然是放在50℃的水浴锅中控制温度，依然会凝固，可能是配制LAB半固体培养基时，琼脂放多了导致这样的结果。
乳酸菌制片镜检，我们可以清楚看到乳酸杆菌菌体杆状，单个或成链，有时成丝状、产生假分枝。
此次实验制备乳酸奶的综合实验真是让我受益匪浅，我们首先要对实验有一个整体的认识，做到心里有数，在实验过程中，始终要树立无菌意识，以保证实验的顺利进行，还有做实验要思前想后，关键步骤要认真细心，可能一个小的环节出错，都会导致实验的失败，还有最重要的一点就是进一步学会与同学合作的精神，这样会让我们事半功倍，不但实验有收获，还能让我们心情愉悦。