每代细胞的生长过程：
①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。

此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。

持续 10分钟一4小时
②贴壁期：细胞附着于底物上，细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。

③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。

细胞株潜伏期一般为6～24小时。

④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。

机制：接触抑制、密度抑制
细胞是否处于对数生长期并不是以数量来定的，一般接种数量多，潜伏期相对会缩短一些，反之，潜伏期会稍长。

并且不同细胞潜伏期是不一样的，故建议最好在实验以前做一下生
长曲线
细胞生长状况的观察
1.细胞计数
（1）［概述］
细胞计数法是细胞培养研究中的一项基本技术，它是了解培养细胞生长状态。

测定培
养基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。

常用的细胞计数有血球计数板计数
法和电子细胞计数仪计数法。

（2）［用品］
a）血球计数板，巴氏吸管。

b）0. 25%胰蛋白酶溶液，无血清培养液。

c）显微镜。

（3）［步骤］
a）准备计数板：用无水酒精或95%酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻
拭干。

b) 制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细
胞悬液。

本法要求细胞密度不低于104/ml，若细胞数很少，应将悬液离心(1000rpm，
5 min)，重悬浮于少量培养液中。

c) 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微
量细胞悬液，加样时不要溢出盖玻片也不能溢入两侧的玻璃槽内，如果产生上述情况
需对计数板冲洗和拭干后重新加样，加样量也不要过少或带气泡。

d) 计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。

细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。

e) 计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度。

细胞数／毫升原液=（4大格细胞数之和／4）× 104
另外随着电子计数仪的出现，使大规模细胞计数工作自动化成为现实。

目前，已有多
种型号的自动计数仪，其基本工作原理是，用PBS液（磷酸盐缓冲液）或生理盐水适
当稀释细胞悬液，移入样品杯中，将样品杯放置在计数仪微孔管下，计数仪吸取0. 5 ml样品进行计数。

被吸取的细胞穿过微孔时改变了流经微孔的电流，产生一系列脉冲信号，计数仪借以进行分类、计数。

不同型号的计数仪其操作程序不尽相同，使用时
应详细参照仪器说明书进行。

（4）［注意事项］
a）消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。

否则会影响细胞计数
结果。

b）取样计数前，应充分混匀细胞悬液。

在连续取样计数时，尤应注意这一点。

否则，前后计数结果会有很大误差。

c）镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。

如细胞团占10%以上，说明消化不充分；或细胞数少于20个／10 mm2，或多于500个／10
mm2时，说明稀释不当，需重制备细胞悬液、计数。

（5）［细胞密度换算］
在细胞培养实验设计中，常根据设计需求制备一定量、一定浓度的细胞悬液，这就涉
及细胞密度换算问题。

稀释错误将导致实验出现偏差。

细胞密度换算实际上仍根据溶液稀释公式，即溶液稀释前后溶质含量保持不变。

C1•V1＝C 2•V2式中C1 、V1代表溶液稀释前的浓度和体积；C2、V2代表溶液稀释后的浓度和体积。

例如：欲配制10 m1，106细胞/ml的细胞悬液，现有l07/m1的细胞
悬液若干毫升，应如何稀释?
已知：C1＝107/ml，C2＝106/m1，V2==10ml
“求V1？根据上式得：
V1＝（C 2•V2）／C1
＝106×10／107
＝1 m1
即取107/m1的细胞悬液1 ml，补加9 ml培养液，即成l0ml， 106/ml的细胞悬液。

2．细胞生长曲线
（1）［概述］
细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。

只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。

因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。

细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

（2）［用品］
与细胞传代和细胞计数法相同
（3）［步骤］
a）取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。

经计数后，精确地将细胞分别接种于21~30个大小一致的培养瓶内（常用10ml培养瓶，亦可用24孔培养板），每瓶细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。

细胞接种数不能过多也不能太少，太少细胞滞留期太长；数量太多，细胞将很快进入平台期，要求在短期内进行传代，曲线不能确切反映细胞生长情况。

一般接种数量以7~10天能长满而不发生生长抑制为度。

同种细胞的生长曲线先后测定要采用同一接种密度，这样才能做纵向比较；不同的细胞也要接种细胞数相同，才能进行比较。

b）酌情每天或每隔一天取出3瓶细胞进行计数，计算均值。

一般每隔24 h取一瓶，连续观察1~2周或到细胞总数有明显减少为止（一般需10天左右）。

培养3~5天后需要给未计数的细胞换液。

c）以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数坐标纸上。

连接成曲线后即成该细胞的生长曲线（图7-1）。

细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20%~30%的误差，需结合其他指标进行分析。

现在很多实验室利用96孔培养板采用MTT法来进行生长曲线测定，较为简便。

（4）［结果分析］
标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的滞留期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。

在生长曲线上细胞数量增加一倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。

细胞倍增的时间区即细胞对数生长期，细胞传代、实验等多应在此区进行。

细胞群体倍增时间的计算方法有两种：○1作图法：在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间，即倍增时间。

○2公式法：按细胞倍增时间计算细胞群体倍增时间：以t 代表时间，N0及Nt代表接种后及培养t小时后的细胞数。

按细胞倍增时间计算公式计算倍增时间，如果倍增时间延长表明药物使细胞增殖能力减弱。

细胞倍增时间（T0）按下式计算：
lg2
T 0＝ t
lgN t—lgN0
1．细胞分裂指数（略）2．细胞贴壁率（略）3．细胞周期（略）。