早在 1910 年就有人用不溶性淀粉选择吸附、 提纯淀粉酶，这是最早的基于生物特异性进行 分离纯化的实例。事实上几乎所有的生物活性 物质都存在类似于淀粉酶与淀粉间的亲和作用， 如酶与底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅助因 子）、抗原与抗体、激素与受体、核酸中的互 补链、多糖与蛋白复合体等。这种利用生物大 分子特异亲和力而设计的层析技术称为亲和层 析（密切关系套色版）。在亲和层析中起可逆 结合的特异性物质称为配基，与配基结合的层 析介质称为载体。
五、亲和色谱操作条件的选择



1．吸附条件的选择 (1）吸附反应条件 吸附条件最好是自然状态下 配体与目的分子之间反应的最佳条件，如缓冲液中 盐的种类、浓度及pH等条件。如果对配体和配基 之间的结合情况不太了解，就必须对盐种类、浓度 和缓冲液的pH进行条件摸索。如果对配体和蛋自 的结合情况比较了解，可以人为设定反应条件，促 进吸附。例如，金黄葡萄球菌蛋白A和免疫球蛋白 IgG之间的结合主要是疏水作用，可以通过增大盐 浓度、调节pH来增强吸附。 (2）流速的控制 流速也是影响吸附的一个因素 流速不能太快；否则，影响吸附程度。

2、常用载体

（1）纤维素 它是自然界中数量最大的大分子生物材料，取材 十分方便。但由于纤维素结构紧密，均一性差， 不利于大分子的渗入。活化后因带有电荷，非特 异性吸附力较强，加上空间位阻等原因，其应用 不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有 关的物质，如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维作固定 相分离细胞提取液中的 mRNA 。 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以 及珠状纤维素。
在亲和层析中常用小分子化合物 (如小分子底物、辅 酶、抑制剂等) 作为配基亲和吸附大分子物质 (如酶 等) 。当配基小分子与载体相连接时，载体所形成的 空间位阻会影响到配基与亲和物的密切吻合，往往 不能形成有效的吸附。活化后的琼脂糖要求与带游 离氨基的配基相连接，如果配基不具有游离的氨基， 就无法与载体相连接。
化了 8000 倍。这种技术不但能用来分离一些在生 物材料中含量极微的物质，而且可以分离那些性质 十分相似的生物物质。 此外,亲和层析法还有对设备要求不高、操作
简便、适用范围广、特异性强、分离速度快、分离 效果好、分离条件温和等优点；其主要缺点是亲和
吸附剂通用性较差，故要分离一种物质差不多都得 重新制备专用的吸附剂。另外,由于洗脱条件较苛 刻，须很好地控制洗脱条件，以避免生物活性物质 的变性失活。


3．配基与载体的结合位点
在多肽或蛋白质等大分子作配基时，由于 它们具有的数个可供偶联的功能基团，必 须控制偶联反应的条件，使它以最少的键 与载体连接，这样有利于保持蛋白质原有 的高级结构，从而使亲和吸附剂具有较大 的亲和能力。

4、载体孔径 载体的孔隙是配体向配基接近的运动通道， 所以载体的孔径大小对吸附剂的亲和能力有 决定性影响。


（3）葡聚糖凝胶
它是经环氧氯丙烷交联，具有立体网格的 多糖类物质，其物理及化学性能比较稳定。 亲和柱的不可逆吸附杂质（如变性蛋白、 脂类等）可用强碱处理除去。与琼脂糖凝 胶相比较，葡聚糖凝胶孔径太小，特别是 经配基偶联后，凝胶膨胀度会进一步变小， 所以它的应用也受到一定限制。


（4）聚丙烯酰胺凝胶


（2）配基与配体的结合应是专一的和可逆的
配基与分离对象的结合应为专一性结合和可逆，这 样才能保证分离与纯化的效果。如用牛胰蛋白酶抑 制剂作配基就不能保证得到单一的胰蛋白酶，因为 它与胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶都有亲和作用。


（3）配基应具有化学活性和稳定性
配基分子上需具有与载体偶联的化学基因，且使偶 联反应尽可能简便、温和，以减少反应时配基亲和 力的损失和载体结构改变。 （4）配基的分子大小必须合适。 常见的配基及洗脱液见教材p91表4-11

（三）载体的活化与偶联

载体由于其相对的惰性，往往不能直接与配 基连接，偶联前，一般须先活化。 载体表面经过活化后产生的活性基团可以在 简单的化学条件下与配基上的氨基、羧基、 羟基或醛基等功能基团发生共价结合反应， 这一过程称为配基的键合。载体表面活性基 团必须具有通用性和高效性，可以与上述配 基上的常见基团发生简单、快速的反应。


一、原理
亲和层析的设计原理和过程大致分为以下三步：
（1）配基固定化：选择合适的配基与不溶性的支
撑载体偶联或共价结合具有特异亲和性的分离介 质。 （2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附酶或其 它生物活性物质，杂质与层析介质间没有亲和作

用，故不能被吸附而被洗涤除去。

（3）样品解吸：选择适宜的条件使吸附的亲和介
聚丙烯酰胺的叠氮衍生物进一步和甘氨酰酪氨酸反 应，可制得酪氨酰衍生物。这种衍生物可以和带有氨 基的配基偶合。
形成氨基衍生物 带酰胺基的聚丙烯酰胺衍生物 可与脂肪族二胺反应制得氨基衍生物，它能与带羧基 的配基偶合。脂肪族二胺中的烃链可以作为配基的 “手臂”，利用烃链的长度，可以控制“手擘”的长 短。
第八章 色谱分离技术
第五节 亲和色谱分离技术
亲和色谱分离技术
(affinity chromatography,AFC,简称 亲和层析法) 是专门用于生物大分子的色 谱分离技术，它是一种基于生物活性物质 之间的可逆、具有专一性作用的分离技术。 即是基于固定相的配基与生物分子间的特 殊生物亲和能力来进行相互分离的。它也 属于一种吸附色谱分离法。

ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
四、影响吸附剂亲和力的因素

1、配基的浓度

在亲和势比较低的时候（ KL ≥ 10-4个摩尔/L ）， 增加配基浓度有利于吸附。
例如，将 N6-（ 6 氨基已烷）-安培-Sepharose 的 用无配基的 Sepharose 稀释 200 倍，使甘油激酶, 乳酸脱氢酶的吸附能力降低；同样的 NAD+亲和 柱用无配基的 Sepharose 稀释 21 倍，使乳酸脱氢 酶吸附能力下降。与此相反，如果将上柱的酶稀 释 200 倍 ， 则 N6- （ 6 氨 在 已 烷 ） - 安 培 Sepharose 的亲和柱吸附甘油激酶和乳酸脱氢酶的 能力不变；将上柱酶稀释 21 倍，则 NAD+亲和柱 对乳酸脱氢酶的吸附能力不变。
三、亲和吸附剂的制备

亲和吸附剂的制备包括三步： 1、载体的选择


2、配基的选择
3、载体的活化与偶联 1、亲和层析对载体的要求
（一）载体的选择


载体在亲和层析中的作用是使配基固定化，同 时提供了亲和对两物质特异性结合的空间环境。 配基与亲和配体的结合势必受到载体的影响。

（1）载体必须能充分功能化，也就是说载体要具 有足够数量的功能基团，或能方便地引入多量的 化学活性基团，以使与配基进行共价连接之用。 （2）载体必须有较好的理化稳定性和生物惰性， 尽量减少非专一吸附。这样的载体就能耐受亲和、 洗涤、洗脱等各种条件下的处理而不改变其膨胀 度、网孔结构和硬度等性质。此外，载体还应不 易为酶破坏，也不能为微生物所利用。这样可使 亲和固定相便于使用和保存。 （3）载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。载 体的亲水性往往是保证被吸附生物分子稳定性的 重要因素之一。同时，亲水性还有助于达到亲和 平衡，并减少因疏水力造成的非特异性吸附。



（ 4 ）载体应具有多孔的立体网状结构，能使被 亲和吸附的大分子自由通过。高度的多孔性对大 分子自由流动是必需的，同时也为提高配基及配 体的亲和有效浓度提供了条件，使之接近溶液中 的状态，这种状态十分有利于亲和对的两种成份 在自由溶液中发生的相互作用。 （ 5 ）理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀 的刚性小球，这样在层析柱中才能保持良好的流 速。通常，精细载体小珠的分离作用能极大地促 进扩散速率低的生物大分子达到扩散平衡，由细 小的凝胶颗粒填充的亲和层析过程，流速虽慢些， 但分离效果良好。



（2）琼脂糖凝胶
它是由 D-半乳糖和 3、6-脱水-L-半乳糖相结合的链状多 糖，商品名为Sepharose。用于亲和层析的主要为交联珠 状凝胶。其琼脂糖浓度有2%、4%、6%几种，相应的商 品称为 Sepharose 2B,4B 和 6B(Pharmacia) 和 Utrogels 一 -2 ，一 -4 ，一 -6 （ LKB ）。这类载体能使吸附物质 保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松 孔径大，流速快。例如， Sepharose 4B 的分子量排阻极 限达上百万，便于大分子通过；载体几乎没有带电基团， 非专一性吸附少。 Sepharose CL 是用二溴丙烷处理的交 联琼脂糖，它的稳定性明显增加，能在的 pH 3~14 中应 用， Sepharose CL 凝胶的这种稳定性，扩大了亲和柱制 备时化学反应选用的范围，并能经受比较剧烈的洗脱条 件。通过溴化氰及环氧乙烷类试剂活化，引入活性集团， 并在极温和的条件下连接上较多配基，吸附量较大。
（二）、配基的选择

按照亲和层析的原理，原则上亲和层析的任 何一方都可作为配基，配基的选用主要取决 于分离对象。如分离酶蛋白时可选择小分子 的底物，也可选择大分子的抑制剂。而作为 理想的配基应符合以下要求。 （1）配基与配体有足够大的亲和力

它是配基对互补分子间的作用力，是制 备高效亲和性的重要参数。亲和性亲和力大 小，可用层析时洗脱体积粗略地加以估计。

(3）吸附时间的控制 延长吸附时间也可促进吸 附，可以在进料后不洗脱，静置一段时间后再进 行后续层析步骤。
(4)进样量的大小 减小进样量，将体积较大的原 料分次进料，可以提高吸附效果 。


2．清洗条件的选择
配体与蛋白之间的亲和力是很强的，并且属于特 异性结合，能够耐受使非特异性蛋自质脱落的清 洗条件。洗涤缓冲液的强度应介于目的分子吸附 条件与目的分子洗脱条件之间。例如，如果蛋白 质在0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液中吸附、洗脱条件 是0. 6 mol/L的NaCl溶液，则可考虑用0.3 mol/L的 NaCl溶液清洗。