目
录
亲和层析的基本原理
制备方法
操作步骤
亲和层析的应用
亲和层析能有效地保持生物活性物质的高级结构的稳定性，其回收率也非
常高，对含量极少又不稳定的生物活性药物的分离极为有效，它是一种专门 用于分离纯化生物大分子的层析分离技术。 相应的配体 底物、抑制剂、辅酶（辅因 子） 所要分离的目的产物 酶
抗体
凝集素 激素
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大
分子结合的配体，如各种凝集素可以结合各种糖蛋白等。 通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合
适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、
偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得 到了广泛的应用。
抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白 脱氢酶和激酶 蛋白质 蛋白质 脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内 切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等
辅酶和磷酸酰苷
过渡金属离子（Cu2+等） 组氨酸 肝素
抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结 合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是 以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的 有效手段。 凝集素
5、洗脱
当亲和作用很大，用通常的方法不能洗脱目标产物时， 可用尿素或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物变性，失 去与配基的结合能力。但应注意目标产物变性后能否 复性。 洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无 亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充分平衡亲和柱， 以备下次使用。
图8.2 亲和层析操作示意图
①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； ③抗微生物和酶的侵蚀； ④最好为粒径均一的球形粒子； ⑤具有亲水性，无非特异性吸附； ⑥含有可活化的反应基团，利于亲和配体的固定化。
例：琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为 2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。Sepharose 4B 的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。
物质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯
化是不利的。
②具有与基质共价结合的基团 与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组 分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸 附作用。 ③配体要能够与基质稳定的共价结合 在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对 其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中 与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明 显影响。 ④配体自身应具有较好的稳定性 在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的较剧烈的 条件，可以多次重复使用。
缺点：基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa＝ 10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子 离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。 另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配 体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易 挥发，所以操作不便。
凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的 总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同 的凝集素与糖结合的特异性不同。例如，常用做亲和配基的伴刀豆 球蛋白A(concanavalin A，con A)与葡聚糖和甘露糖的亲和结合作 用较强。
辅酶和磷酸酰苷
各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）的存在下表现其生 物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和作用。辅酶主要有 辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadenine dinucleotide，NAD）、辅酶Ⅱ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NAD phosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP） 等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外，磷酸腺苷 （adenosine 5’-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷 （adenosine2’，5’-diphosphate，ADP）的腺苷部分与上述辅酶 的结构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用，可用做这些酶 的亲和配基。 过渡金属离子
为：
生物亲和层析 利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和作用，通常 具有高的选择性，典型的物质对有酶-底物， 酶-抑制剂，激素-受 体等。
免疫亲和层析
利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统柱进行各种类型的免疫检测被称为免疫检测法，特别适用于 检测含量低微的样品。
偶联。
基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表 面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 不同的载体活化需要不同的活化剂。 常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、
高碘酸盐、苯醌等。
活化溴化腈活化法
溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺 碳酸活性基团，它可以和伯氨（NH2）反应，主要生成异脲衍生物。 反应如下：
2、配体的选择
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。 如抑制剂、底物、抗体、辅酶等。 依据蛋白结构设计配体要考虑两个重要因素： ① 正确地预计被设计的配体构像 ② 正确预计配体的亲和力 优良配体须具备的条件： ① 与待纯化的物质有较强的亲和力。 一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析 时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化
金属离子亲和层析 金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统，目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，
如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利
于蛋白质与固定化金属离子结合，这是用于蛋白质分离纯化的根据。 金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸
环氧基活化法
在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合 物；在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶 联。
优点：活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的N－C、O－ C 和S－C 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用 寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，没有毒性。 缺点：用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH 为9-13，温度为20-40℃。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能 不适用。
配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法。
在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。配基必须偶联于不溶 性母体上。母体又称为载体或担体，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。
2、亲和作用的机理
结构特点 钥匙和锁孔的关系 相互作用力 静电作用、氢键、疏水性相互作用、配位键、弱共价键 等。 影响亲和作用的因素 离子强度、pH值、抑制氢键形成的物质、温度、液体离
改变离子强度
专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制剂、底物类似 物） 被吸附物质结合 竞争性地与 配体结合
2、基质活化
当用小分子化合为作为配体时，由于空间位阻作用，难于与配对
的大分子亲和吻合，常在母体与配体之间引入适当长度的连接臂。
要使不溶性母体与配体偶联或通过连接臂与配体偶联，必须先使 母体活化。即使母体引入某一活泼的基团，才能以共价键与配体
主要内容
亲和层析的基本原理
制备方法
操作过程
亲和层析的应用
1、操作流程
层析前：制备亲和层析剂 选择 根据欲分离物质特性 根据配基分子大小及基团特性 配基 选择 载体 偶联
亲和层析剂
洗脱：削弱目的产物和亲和吸附配体间的相互作用。 包括：非专一性洗脱和专一性洗脱
非专一性洗脱：
改变温度 改变pH值
的巯基结合，含有不同数量的这些基团的蛋白质可以通过金属离子
亲和层析得到分离。 拟生物亲和层析 利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位，以人工 合成的配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析。
主要内容
亲和层析的基本原理
制备方法
操作过程
亲和层析的应用
1、载体的选择
一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基来修饰载 体，以制备所需的亲和吸附介质即固定相。 作为载体的物质应具有：
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性
配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。
特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合
的配体。如生物素－亲和素、抗原－抗体、酶－抑制剂、激素－受体 等，它们结合都具有很高的特异性。
另外还有甲苯磺酰氯法、双功能试剂法等。
3、偶联
经过活化和洗涤过的基质与等体积的0.2-0.5mol/L碳酸 盐缓冲液混合，缓慢搅拌2小时，或室温下过夜，以便配体和 基质充分偶联而形成固体载体。对于偶联极牢固会丧失活性 的大分子物质配体，则应在低pH值缓冲液中反应或活化基质 预先在pH8.3的碱性溶液中进行适当的水解作用，这样可提高 配体的活性。 配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去除未偶联 的配体。另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的活 性基团，也就是使基质失活，以免影响后面的亲和层析分离。 例如对于能结合氨基的活性基团，常用的方法是用2－乙醇胺、 氨基乙烷等小分子处理。
4、配体结合量的测定
配体结合量一般是用每毫升或每克贮存胶束缚配体
的量来表示，测得的配体结合量，可作为决定亲和 吸附剂实际用量的参数，具体测定方法有直接测定 法（2,4,6-三硝基苯磺酸钠的颜色试验和根据配体 的特征来进行测定）和间接测定法（推算法和根据 亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的 结合量）。