6 火警：勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。若酒精乙醇乙醚等有机溶 剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。
二、无菌操作技术
实验目的
1 掌握常用的细菌接种方法 2 熟悉细菌生长现象的观察方法
（一）细菌的分离培养和接种技术
接种工具
接种针和接种环 L型玻璃棒
接种环境
接种罩、超净工作台或无菌室内进行。
划线为连续划线,不能间断.应占满平皿.划 线不能交叉重复.
每次划完后应灭菌.
连续划线法
2.斜面接种法：
用于菌种移种，以进一步鉴定 和保存菌种。
3.半固体穿刺接种法：保存菌种或观察细菌的动力和生 化反应。 4.液体接种法：用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体 培养基
的接种。
将上述已接种细菌的培养基置37℃恒温 培养箱中孵育18～24h，观察细菌的生长 现象。
（二）细菌在培养基上的生长现象
1.细菌在固体培养基中的生长现象
菌落
定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖， 形成单一肉眼可见的细菌集团。
菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、 透明度、湿润度、黏度、溶血性。
菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。
菌落
菌苔
菌落与菌苔
2.细菌在液体培养基中的生长现象
步分为革兰染色阳性菌和革兰染色阴性菌，在临床上具 有非常重要的意义.
目的：
1、掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法 2、熟悉革兰染色的原理和临床意义
原理：
1、通透性学说 2、等电点学说 3、化学学说
通透性学说
G+菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联度高，脂质 含量少，乙醇不易脱除染料。
G-菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度低，含大 量脂质，乙醇易脱除染料。
避免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告。 实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生的废料要
扔在指定容器内；实验完毕清理台面，值日生严格认真打扫 卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。
实验室意外紧急处理办法
1 皮肤破损：去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后2%碘酊或2% 红汞涂抹。
2 烧伤：局部涂凡士林，2%鞣酸或2%苦味酸。 3 化学药品腐蚀伤：若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶
接种方法
1.平板划线接种法：
目的：使混合的细菌呈单个分 散生长，形成单个菌落，以便 获得纯菌。
方法：
分区划线法：适用于含菌量 较多的标本。
连续划线法：适用于含菌量 较少的标本。
Hale Waihona Puke 分区划线划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻 接触,以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划 破琼脂.
第一次划线应占平皿面积的1/10,以后每次 划线约占面积的1/4—1/5.
操作在通常情况下不会引起人类或 者动物疾病的微生物
病原生物学实验室规则
学生进病原生物学实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折， 要经常清洗消毒。
进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定 的储物柜内。
严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。 手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手；
Please attention!
1.您进入实验室时，请穿着白大衣以保护自身安全！ 2.本实验课需要显微镜，请您携带学生证去四楼显微镜
室领取！ 3.请您不要随意触碰实验用品，以免发生意外！
实验一 （5学时）
张文钰 病原生物学与免疫学教研室
sqjcbwm@
一、实验室生物安全
熟悉 （1）微生物学实验室生物安全意义 （2）实验室规则
等电点学说
G+菌等电点（pI2~3） G-菌等电点（pI4~5）
在相同pH条件下G+菌所带负电荷比G-菌多，所以 与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。
化学学说
G+菌菌体内含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶 紫等染料牢固结合，使已着色的细菌不易 被乙醇脱色
G-菌 菌体内含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色
器材和试剂：
1、菌种
金黄色色葡萄球菌 大肠杆菌
2、试剂 革兰染色液
初染液
结晶紫
媒染液
卢戈氏碘液
脱色液
95%乙醇
复染液
稀释石碳酸复红
3、其它
接种环 载玻片 染色盘 洗液瓶
混浊：大多数细菌 沉淀：多见于链状排列的细菌。 菌膜：专性需氧菌（如结核分枝杆菌、枯草杆
菌） 。
细菌在液体培养基中的生长现象
菌膜 对照
菌沉淀
均匀浑浊
3.细菌在半固体培养基中的生长现象
有鞭毛细菌：
在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺 线边缘模糊。
无鞭毛细菌：
只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。
细菌在半固体培养基中的生长现 象
无动力 现象
有动力 现象
三、细菌的形态学检查
形态学检查分类
一、不染色标本检查(活体） 悬滴法 压滴法
二、染色标本检查 单染法：简单染色，一种染料 （美兰染色） 复染法：复杂染色，两种以上染料（革兰染
色、抗酸染色）
革兰染色(Gram stain)
1884年由丹麦医师Gram创立 革兰染色是最常用的一种染色方法，可以将细菌初
2004年4月，中国疾病预防控制中心科研人员，采用 未经论证的非典病毒灭活方法，在不符合防护要求的 普通实验室内操作非典感染材料，造成北京、安徽发 生非典疫情。
2010年12月，东北农业大学28名师生在“羊活体解剖 学实验课”中感染布鲁氏菌病。2011年6月，东北农 业大学免去该校动物医学院院长和党支书职务。感染 病菌的学生称，羊没有被检疫，被染病的羊那天被几 个班级的学生重复使用。
液洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用2%硼酸洗涤中和 （若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡1~2滴滴眼）。
4 菌液入口：立即吐入消毒容器内，1：1000高锰酸钾或3%双氧 水漱口，根据菌种服用抗菌药物。
5 菌液污染台面：2%~3%来苏尔或0.1%新洁尔灭覆盖30分钟后抹 去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡3分后肥皂和清水洗净。
感染的主要原因是： 防护意识不强； 操作失误，防护条件不足。
P4实验室
P3实验室
P2实验室
P1实验室
操作能够引起人类或者动物非常严重 疾病的微生物，尚无有效预防或治疗 方法
操作能够引起人类或者动物严重疾病， 比较容易直接或者间接在人与人、动物 与人、动物与动物间传播的微生物
操作能够引起人类或者动物疾病，但一般 情况下对人、动物或者环境不构成严重危 害