反而降低，有时发生荧光猝灭效应。
14.3 荧光和磷光分析仪器
（一）荧光分析仪器——主要由光源、2个单色器、
液槽、检测器和显示器组成
I0
光源 第一单色器
I
液池
吸收检测器
l ex
第二单色器
与分光光度计有两点不同
①两个单色器
l em
检测器 放大器及记录器
②检测器与激发光互成直角
1、光源


激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的 发射强度；适用波长范围宽 分光光度计计中，常使用氘灯、卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
T1 → S0跃迁
电子由S0进入T1的可能过程：
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1
发光速度很慢： 10-3～10 s 。 光照停止后，可持续一段时间。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
荧光 ( 磷光 ) ：光致发光，照射光波长
如何选择？
1. 荧光(磷光)激发光谱
固定发射波长，化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光激发波长的关系曲线
不少有机配体是弱荧光体或不发荧光，但与Mn+形 成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产 生荧光 例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+（如 Al3+、 Mg2+）形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加 M 强 OH OH
N
N


（4）取代基的类型

取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影 响。分成三类：
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
不产生荧光
产生荧光
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 法测定
• 3，4-苯并芘是强致癌物
lex = 386 nm lem = 430 nm
（2） 刚性平面结构—较稳定的平面结构

具有强荧光的分子多数有刚性平面结构Hale Waihona Puke 光致发光及影响荧光发射因素
荧光 涉及吸收和发射两个过程 1.基态--激发态
基态 ﹡
n ↑↓ ↑↓ ↑ ↑↓ ↑↓
激发态
↑ ↑↓ ↑↓ n→﹡ S=1 M=2S+1=3 激发三重态 T ↓ ↑↓ ↑↓
分立轨道上 非成对电子 平行自旋更 稳定

→﹡
净电子自旋 S=0 分子多重态 M=2S+1=1 单重基态 S0 S=0
5. 溶液荧光的猝灭

荧光猝灭——荧光物质与溶剂或其它物质之间发生 化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效 率f 下降称为荧光猝灭。


使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂
氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是 常见的荧光猝灭剂

碰撞猝灭—— M +l激 → M*；M* + Q → M + Q +热 静态猝灭——荧光分子与猝灭剂形成不发荧光的基 态配合物
荧光显微镜
38
应用示例
利用三明治夹心免疫法研究MCF-7 肿瘤细胞表面MUC1蛋白的 表达，以正常细胞HepG2为对照
From left to right: Hoechst fluorescence excited at 405 nm; FITC fluorescence excited at 488 nm; bright field and merged. Scale bars: 20 μm.
利用汞蒸气放电发光的 应用最广泛的一种光 光源；常用其发射365 nm、 源，可发射 250~800nm 405 nm、 436 nm 三条谱线 很强的连续光源 以365 nm 的谱线最强
2、单色器

荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析， 不能获得光谱

大多数荧光光谱仪采用两个光栅单色器，有较高的分
二、分子荧光分析法的特点
1. 灵敏度高

荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光 强度，可提高荧光强度。
激发光 强 发射荧光 强 激发 物质
荧光检测的信号是发射光的绝对强度，采用高灵 敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光 分析法比分光光度法低2~4个数量级
2. 选择性好

不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发 光波长
较高激发态 吸收能 量受激 基 态 光辐射 退激
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量

根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为 以下几类： 光致发光：以光源来激发而发光
荧光—荧光分析法
磷光—磷光分析法
电致发光：以电能来激发而发光 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法
发射荧光的能力， f 越大，荧光越强，在0~1之间
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数 有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射
2. 荧光（磷光）与有机化合物结构的关系

物质只有吸收了紫外可见光，产生 *、n * 跃迁，产生荧光

*与n *跃迁相比，摩尔吸收系数大 102~103，寿命短
但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质， 分子形式无荧光，离子化后显荧光
OH
_ O
例：—苯酚 无荧光 有荧光
另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性
4. 内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧
光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱 的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。

14.2
荧光和磷光光谱法
一、荧光和磷光光谱的产生 具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁 产生荧光和磷光 基态分子 光照激发 价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基 态

在光致激发和去激发的过程中，分子中的价电 子（ 、n电子）处于不同的自旋状态，通常用 电子自旋状态的多重性来描述。
辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧
光光谱

第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳 激发波长l ex ，用此激发光激发液池内的荧光物质 第二单色器作用：滤掉杂散光和杂质所发射的干扰光， 用来选择测定用的荧光波长l em。


在选定的l em 下测定荧光强度，定量分析
3、样品池 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面 都透光，只能用手拿棱或最上边 4、检测器 把光信号转化成电信号, 放大, 直接转成荧光强度 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏 度，荧光光度计采用光电倍增管 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是 因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光 强度可 大大提高荧光强度 5、读出装置 记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱 和发射光谱

不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光 波长
比较容易排除其它物质的干扰，选择性好

3. 实验方法简单
4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广

发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物， 广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧 产品分析、卫生检疫等领域。 荧光法比磷光法应用广泛

*跃迁常产生较强的荧光 n *跃迁产生的荧光弱，但可产生系间跨跃，产 生更强的磷光
（1） 共轭体系——有较强的荧光 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭 程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭程度越 大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强
f 苯 萘 蒽 菲 0.11 0.29 0.46 l ex /nm 205 286 365 lem /nm 278 310 400 350
五、荧光强度与荧光物质浓度的关系

用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质 时，产生荧光，荧光强度If 用仪器测得，在荧光 浓度很稀时，荧光物质发射的荧光强度If 与浓度 呈线形关系

只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或
痕量组分，灵敏度高

浓度高时， If与C不呈线形关系，有时C增大， If
M=2S+1=1 激发单重态 S
允许
允许
禁阻
2.激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过 辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛豫
内转换 S2
内转换 振动弛豫 系间跨越
S1
能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光 T2
（c）影响不明显的取代基 —— -NH3+、-R、
- SO3H等
四 环境对荧光、磷光的影响
1. 溶剂的影响 同一荧光物质在不同溶剂中会有不同的荧光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长红移，荧光
强度增大
2. 温度的影响——低温下测定，提高灵敏度
辐射跃迁的速率基本不随温度变，非辐射跃迁随温
度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升
620
3.激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长。 振动弛豫消耗了能量+溶剂的弛豫作用 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生 不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。 发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回 第一激发单重态的最低振动能级