激发光谱的形状与发射波长也无关
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c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称 关系。
➢基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似； ➢基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等
4 3 2 1
4 3 2 1
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荧光强度(I f ) 吸收的光强度(Ia
)
f
kf
kf
ki
影响因素：荧光产生过程中， 辐射和无辐射过程； 与每一过程的速率常数有关；
kf 分子结构决定（内因）；
主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。
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（1）跃迁类型：具有电子跃迁类型的结构
激发
荧光
n
振动弛豫
n
跃迁是产生荧光的主要跃迁类型
S2
反的自旋方向，即自旋配对。
S1
单重态: 如果分子中全部轨道里的
电子都是自旋配对的, s=0, M=1
三重态：电子在跃迁过程中还伴
随着自旋方向的改变，s=1,M=3
S0
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T1 T2
3.1 荧光分析的基本原理
3.1.1分子发光的产生
振动驰豫 非
辐 射
内转换
跃
迁
系间跨越
化
去
学
活
反
化
应
外转换 熄灭或猝灭
(nm)
278~310
285~365
310~405
280~390
285~345
相对荧光强度
10
18
20
20
20
2）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光 —C=0， — COOH ， —NO2
不产生 p →π共轭
O
NO2
硝基苯：不产生荧光、弱磷光
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二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S1 →T1的系间窜跃产率接近1
ex =290nm (MAX)
em= 620nm(MAX)
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
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3.1.3 荧光与分子结构的关系 分子荧光产生的必备条件
分子必须能够吸收激发光 分子必须具有一定的荧光量子产率
f
发射的光量子数 吸收的光量子数
3）取代基的位置
空间位阻对荧光发射的影响
-O3S
H3C N CH3
H3C N CH3 SO3-
F=0.75
立体异构体对荧光发射的影响
H C C H
反式二苯乙烯 强荧光物质
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F=0.03
C CH H
顺式二苯乙烯 非荧光物质
（5）重原子取代基效应
—Cl， — Br ， —I
S1 →T1的系间窜跃由于重原子的存在增强 含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。
•较大的摩尔吸光系数 •较短的激发态寿命10-7~10-9s •串越至三重态几率小
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共轭度越大，荧光越强。
原因 ：共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易
产生。
化合物
苯萘
蒽
丁省
戊省
F
0.11 0.29
0.46
0.60
0.52
λexmax(nm) 205 286
365
390
580
λ max em
(nm)
278
322
400
480
642
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0.92 1
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0.18
（4）取代基效应
1）给电子取代剂加强荧光 —HN2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR ， — CN
产生 p →π共轭
化合物
苯
苯酚 苯胺 苯基氰 苯甲醚
λ
em max
荧光分析的基本原理
1572：西班牙植物学家N.Monardes观察到荧光现象 1855：Stokes 研究荧光，提出作为一种分析手段 1865：Goppelsroder首次应用方法 1886：提出荧与化学结构关系的经验法则 1968：Jette和West 第一台光电荧光计 1956：第一台商品化的荧光分光光度计
b.发射光谱的形状与激发波长无关
分子被激发到高于S1的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和 振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到S1电子态的最低振 动能级
尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都 是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与 荧光体被激发至哪一个电子态无关。 无论激发波长是λ1还是λ2，荧光的波长都是λ΄2
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
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单色器
吸收池
单色器
检测器
信号显 示系统
3.1.2 激发光谱和发射光谱
a.Stokes位移
在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为 Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液 中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发 射之间产生了能量损失。
特点：
1)灵敏度高（1-100 ppb)：有的可达0.01ppb； 2)选择性强； 3)方法简单快速，用样量少; 4)提供比较多的物理参数。
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分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学 和光能 等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态 返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。
荧光和磷光: 当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的
发 射 光 子
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荧光 磷光
激发光去除后，荧光立即消失 激发光去除后，磷光不会立即消失
激发光谱:固定测量波长(选最大 发射波长),化合物发射的荧光( 磷光)强度与照射光波长的关系 曲线 （图中曲线I ）
激发光谱形状与吸收光谱形状完全相 似，经校正后二者完全相同！
发射光谱：固定激发光波长(选 光源 最大激发波长), 化合物发射的荧 光(或磷光强度)与发射光波长关 系曲线(图中曲线II或III)。
特殊性，会发出比吸收波长更长的不同波长的可见光， 当紫外光照射停止时, 随之消失的光叫做荧光，不立 即消失的光叫磷光。
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3.1.1分子发光的产生
分子能级=电子能级(Ee)+振动能 级(Ev)+转动能级(Er)。
电子激发的多重度：M=2s+1
Pauli不相容原理：分子中同一轨
道所占据的两个电子必须具有相
S1
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4
固定ex=290nm (MAX)
1→1
4000
1→ 3
3600
3200
1→ 2
1→2
2800
1→4
2400
2000
1600
1200
1→4
800
S0
400
1→1Leabharlann 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900