⒊样品:吸附剂=1:30---40
柱长:直径=7.5:1
一般为湿法装柱。
次甲基兰的紫外光谱
甲基橙的紫外光谱
八、对实验结果和实验中某些现象的分析讨论
吸附色谱柱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱溶剂的选择,而且与制成的色谱柱有关;要求柱中的吸附剂用量为被分离样品量的30-40倍,若需要可增至100倍。
柱高与直径之比为4:1至10:1,一般为7.5:1。实验室常用的色谱柱,其直径在0.5-10cm之间。当吸附物的色带占吸附剂高度的1/10—1/4时，此色谱柱已经可作色谱分离了。色谱柱或酸式滴定管的活塞不用涂润滑脂。
3．洗脱速度要保持在1滴/秒，速度过快，物料还来不及平衡，影响分离效果；过慢，会导致柱பைடு நூலகம்扩散现象严重，均会影响分离效果。
六、实验数据记录
1．用95%乙醇洗脱分出蓝色色带，得次甲基兰
2．然后改用水洗脱分出黄色色带，得甲基橙
七、实验结果计算及曲线
⒈吸附剂
柱层析常用吸附剂有氧化铝,硅胶,氧化镁,碳酸钙及活性炭等,吸附剂要求颗粒大小均匀,越细分离效果越佳,但此时洗脱阻力也会增大,所以要选择颗粒大小合适的吸附剂.
装柱可以采用湿法或干法，干法装柱是将干吸附剂倒入柱内，填装均匀，
然后加入少量溶剂。无论采用哪种装柱都不要使吸附剂有裂缝或气泡，否则影响
分离效果，一般说来湿法装柱较干法紧密均匀。
本实验采用湿法装柱。
1、色带有重叠现象，即柱内出现彩色色带，这是由于样品进入带较宽，扩散现象严重之故，但由于甲基橙与次甲基兰极性相差甚大，随着洗脱进行，基本上可以得到单一化合物。
酸>醇,胺,硫醇>酯,醛,酮>烃>卤化物,醚>烯>饱和烃
强吸附性的化合物要用强极性溶剂来洗脱。
作为洗脱剂的溶剂要求其具有一定极性,适合于被分离物的分离,体积尽量要小,此外要求易挥发,易除去(乙醚等挥发性太大的溶剂不合适)。
洗脱剂的极性按下列次序递增：
乙烷或石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸
如果遇到极性相似的化合物，分离就不完全，所以必须严格基本操作。
2、如果洗脱剂选择不合适，会使分离不能进行。洗脱剂极性过大，被分离物一起被洗脱，达不到分离目的。洗脱剂极性过小，物质不被洗脱。所以一般要用薄层层析法来试验找到合适洗脱剂，在薄层上二个被分离物Rf值相差较大，斑点清晰，这样的洗脱剂体系在稍减少极性的条件下，可用于柱层析。
四、实验用主要仪器设备、消耗品
仪器设备名称
规格
消耗品名称
规格
色谱柱
次甲基蓝
工业纯
锥形瓶
50,100,150,250ml
甲基橙
自制
滴液漏斗
250ml
乙醇
95％
铁方座
Al2O3
柱色谱用（中性）
铁夹
铁圈
量筒
10ml,100ml
台秤
五、实验原理及原始计算数据、所应用的公式
吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大，经过各种活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端,当洗脱溶剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集。对于柱上不显色的化合物分离时，可用溶剂洗脱时分别收集洗脱液，逐个加以鉴定。
实验项目：柱层析分离甲基橙和次甲基蓝染料
一、实验目的
1．了解柱色谱分离有机化合物的原理；
2．初步掌握色谱柱装填和洗脱的操作方法。
二、实验内容
1．用中性Al2O3为固定相装填色谱柱；
2．依次以95%乙醇和水作洗脱剂分离次甲基兰和甲基橙。
三、实验示意图
柱层析分离装置
湿法装填色谱柱→加次甲基兰和甲基橙混合液→用95%的乙醇洗脱→分出蓝色色带层(次甲基兰)→改为水洗脱→收集黄色色带层(甲基橙)。
氧化铝分酸性、中性和碱性三种，本实验应用中性氧化铝。
吸附剂的活性根据其含水量而定。
吸附剂活性等级含水量
Ⅰ0%
Ⅱ3%
Ⅲ6%
Ⅳ10%
Ⅴ15%
所以为了提高吸附剂活性,可以用加热脱水的方法来获得。
⒉溶剂
化合物的吸附能力与它的极性成正比，具有较大极性基团的化合物，其在吸附剂上吸附能力较强。
氧化铝对各化合物的吸附性按以下次序递减：
实验精确度%
九、实验方法指示及注意事项
1．色谱柱一定要装填紧密。若柱中装填时留有气泡或各部分松紧不匀时，会
影响渗滤速度和显色的均匀。
2．加料时须沿柱壁绕圈加入，防止局部样品过多，或者把吸附剂冲起而影响分离效果。
3．在分离过程中，自始至终须使整个吸附剂浸泡在溶剂中。否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗滤和显色的均一性。
1．从分子结构看出,甲基橙中含—SO3Na基团,它具有比次甲基兰更大的极性，因此在用乙醇洗脱时只有次甲基兰可被洗脱下来，极性较大的甲基橙必须用水作洗脱剂。
2．装柱的紧密与否,样品吸收带是否狭对柱层析分离影响颇大.
加入样品量不宜过大,否则会引起过载,分离效果不好,将含样品的溶液进入吸附柱时,必须待样品液全部被吸附剂吸附后,才能用少量洗脱剂洗涤,洗涤液又全部进入柱后,才能开始用大量溶剂洗脱,否则样品色带宽大,在洗脱过程中,会因扩散现象造成色带彼此重叠,使分离难以进行。色谱柱装填要紧密、均匀,疏松或不均匀的柱子均会引起涌流扩散现象,导致分离效果欠佳。
4．一旦样品加入开始过柱后，必须保持洗脱剂的流速恒定，不得关闭活塞，否则将会造成被分离样品在分离过程中重新混合，严重影响分离效果。