乙肝表面抗原的 ELISA 法定量分析方法学验证姓名Z P学号0925400072班级09 级医学检验本科二班指导老师沈 富 兵二〇一三年四月乙肝表面抗原定量测定的方法学验证作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500）【摘要】目的用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。
方法运用ELLISA法定量测定乙肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml 的2 倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。
结果HBsAg 线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。
结论ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。
【关键词】乙肝表面抗原方法学验证标准曲线精密度ELLISA病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。
乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。
酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。
此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。
我们采用对已知抗体浓度的样品进行E LISA的定量检测，通过对其数据的分析来验证ELISA法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。
1.1.2 仪器及酶标板酶标仪：Bio-Rad680；洗板机：Bio-Rad1575；超纯水系统：Millipore Elix；电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。
1.1.3 溶液配制⑴0.01M pH7.4的PBS 缓冲液：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4, 溶于800ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。
⑵质控品：用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml 三个质控品，每质控品1ml。
首先取450μl的8ng/ml 的标准品到C1号EP管中再向其中加入150μl的PBS 缓冲液，即配制成了6ng/ml 的质控品，再取300μl C1 号EP 管内的溶液到C2 号EP管内，再向C2号管内加入300μl的缓冲液混匀。
即配制成了3ng/ml 的质控品。
接着取300μl C2 号管内的液体到C3 号EP管内，再加入300μl的缓冲液混匀，即配制成了1.5ng/ml的质控品。
具体方法如下图1C16ng/ml1.2 检测方法1.2.1 标准曲线各浓度的配制C23ng/ml图1C31.5ng/ml⑴用PBS缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。
⑵先取6个EP管分别标记为对应的浓度。
⑶取400μl标准品于标记为①的EP管中，再取200μl①号管内液体于②号管内再向②号管中加入200μl的缓冲液混匀，即配制成了浓度为4ng/ml 的标准品。
⑷再从②号管内取200μl的液体到③号管内，接着取200μl的缓冲液到③号管内混匀，即配制成了2ng/ml 的标准品。
⑸从③号管内取200μl的标准品到④号管内，再向④号管内加入200μl的缓冲液混匀，即配制成了1ng/ml 的标准品。
⑹用同样的方法，配制好浓度分别为0.5ng/ml、0.25ng/ml.的标准品体积分别为200μl、200μl、400μl备用。
具体方法如下图2S1 8ng/mlS24ng/mlS32ng/mlS41ng/mlS50.5ng/S60.25ng/ml ml图21.2.2测定方法⑴取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，在相应孔中加入已配制好的系 列标准品、质控品及空白对照；图 3注：双线框区域为标准品,浓度依次为 8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml ，三线框区域为质控品，浓度依次为 6、3、1.5ng/ml ，粗框区域为空白对照加入的是 PBS 缓冲液，每个孔内加入的均是 50μl 。
⑵37℃温育 30min ，洗板 4 次；⑶加入酶标抗体，生物素二抗，50μl/孔；⑷37℃温育 30min ，洗板 4 次；⑸加入 A 、B 液，50μl/孔，37℃温育 15 分钟； ⑹加入终止液，50μl/孔。
1.3 标准曲线制作及结果计算⑴酶标板放入酶标仪，盖上盖子；⑵在电脑上打开 Microplate Manager 5.2 软件；⑶选择 450nm 波长（参照波长 630nm ），设置 LAYOUT 和报告模式，测定 各孔吸收值；⑷输入标准品各浓度值，以双对数法制备标准曲线，获取各孔的浓度值， 打印标准曲线图和计算结果。
1.4 统计学方法○- 4 6 1.5 ○- ○-○- ○- ○-○-8 8 6 3 1.5 3 4 1.5 3 6 2 2 ○- 1 1.5 ○- 3 6 1 0.5 0.5 361.5○- 0.250.25○-○- ○- ○-用 Microsoft Excel 处理实验数据。
2 结果2.1 测得的OD 值如下表图 4注：图 4 与图 3 相对应2.2 标准曲线图 5由上图可得出如下结论：标准曲线以浓度为横坐标，以测得的 OD 值为纵坐标。
由对应浓度和 OD 值得出的散点连成一条直线后，散点基本都在直线上，说明散点的线性非常好。
在以后检测乙肝表面抗原浓度的时候可以根据测出的 OD 值在标准曲线上找出1.73901.6380 1.0850 0.6920 0.3380 0.0150 0.8840 0.8880 1.2170 0.6740 0.3530 0.0090 0.5360 0.5090 1.2180 0.6560 0.3380 0.0100 0.2720 0.2600 1.2330 0.6740 0.3470 0.0090 0.1490 0.1380 1.2480 0.6960 0.3430 0.01200.0620 0.07100.00900.0120 0.0020 0.0090 0.00900.0110 0.0090 0.0110 0.0100对应的浓度。
2.3 准确度（回收率）计算各质控品高中低三个浓度平均回收率分别为92.59%、100.887%、93.68% 都在正常范围内如表1 所示。
ELISA法检测VEGFR2-Fc的回收率准确度（回收率）计算测定值(ng/ml)回收率(%)平均回收率SD(%)VEGFR2-Fc(ng/ml)64.998 83.365.637 93.956 5.642 94.0336 5.715 95.256 5.787 96.453 3.093 103.13 3.005 100.16732.918 97.26733.005 100.1673 3.112 103.7331.5 1.377 91.81.5 1.450 96.6671.5 1.377 91.81.5 1.421 94.7331.5 1.401 93.4表1 2.4 精密度计算2.4.1 板内精密度RR(%)92.59 5.30 100.887 2.60 93.68 2.07板内精密度质控品各浓度组的RSD都小于15%，精密度良好，如表2所示。
板内精密度VEGFR2-Fc （ng/ml）测定值1测定值2测定值3测定值4测定值5X SRSD(%)6 4.998 5.637 5.642 5.715 5.787 5.694±0.318 5.585 3 3.093 3.005 2.918 3.005 3.112 3.027±0.078 2.5771.5 1.377 1.450 1.377 1.421 1.401 1.405±0.0312.210表22.4.2 板间精密度板间各组浓度质控品RSD都小于15%，说明板间精密度达到标准。
如表3所示。
板间精密度测定值测定值测定值测定值测定值X S RSD(%) VEGFR2-Fc（ng/ml）64.998 5.637 5.642 5.715 5.787 5.694±0.318 5.58565.471 5.423 5.674 5.323 5.746 5.5274±0.177 3.2026 5.773 5.674 5.782 5.547 5.667 5.689±0.096 1.6873 3.093 3.005 2.918 3.005 3.112 3.027±0.078 2.5773 2.815 3.335 3.187 3.221 2.933 3.098±0.216 6.9723 2.886 3.344 3.118 3.234 2.997 3.116±0.182 5.8411.5 1.377 1.450 1.377 1.421 1.401 1.405±0.0312.2101.5 1.226 1.257 1.227 1.564 1.334 1.322±0.142 10.7411.5 1.665 1.243 1.236 1.541 1.320 1.401±0.192 13.704表32.5 检测限（LOD）计算：取空白孔的OD值的均数加2倍标准差。
空白孔的OD值的均数=0.0098空白孔的OD值的标准差=0.0028LOD=0.0098+2*0.0028=0.01543 讨论通过图4、图5和表1、表2、表3可知本次实验的准确度、板内精密度、板间精密度、LOD值都复合实际，且各数据都趋于理想，对此我们做出分析：HBsAg是乙肝病毒感染后最早出现的血清标志物之一，因此HBsAg的检测是诊断肝炎病毒感染的重要依据。
而针对这项检测的检测方法的灵敏度与高特异性的高低以及二者的结合程度是影响检验结果的重要因素，直接关系到临床诊断和用药，所以对HBsAg的检测方法的建立和方法的验证是实验成败的关键所在。