土壤中放线菌的分离
实验目的： 1 掌握配制合成培养基的一般方法。

2 掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

3 掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

4 掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

实验材料：
药品：可溶性淀粉、 KNO 3、NaCI、K2HPO 4?3H 2O、MgSO 4?7H 2O、FeSO4?7H2O、琼脂。

其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。

实验原理：
高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。

这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO 3 、 NaCI 、 K2HPO 4?3H 2O 、MgSO 4?7H2O 作为无机盐， FeSO4?7H2O 作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。

放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。

由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。

分离放线菌常用稀释倒平板法。

根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。

如果培养基成分改变，或土壤预先处理（1h1）0或加入某种抑制剂（如加数滴 10% 酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。

再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。

实验步骤：
1.高氏一号合成培养基的制备
高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用）
可溶性淀粉 20g ，硝酸钾 1g, 氯化钠 0.5g ，K2HPO4 ?3H2O 0.5g ，MgSO4 ?7H2O 0.5g ，FeSO4 ?7H2O O.OIg ，琼脂 20g，水 1000ml , pH7.2 〜7.4。

配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，
溶化后，补足水分至 1000ml o 112 C灭菌20分钟。

2. 土壤中放线菌的分离
（ 1 ）待测样液的制备
选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。

先除去表层约2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取 2〜10cm处的土壤。

盛土的容器应是无菌的。

将 5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。

称土样 1g 于盛有 99mL 无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡 10〜20min ，
使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置 30s。

另取装有9ml无菌
水的试管3支，编号10-3、10-4、10-5。

用无菌吸管无菌操作取 10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中，并吹吸吸管 2~3次，使与9ml水混匀，即为10-3浓度的土壤稀释液。

依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换 1支无菌吸管）。

稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。

（ 2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌
取 2支1 毫升移液管分别从 10-5、 10-4菌悬液中吸取 1 毫升菌悬液，分别注入编号 10-5、 10-4 的培养皿内。

将温度为45〜50 C的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混
合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28 C左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。

（ 3 ）涂布平板法分离土壤中放线菌
取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（ 10-4、10-5
）、组别、姓名、操 作日期等。

每个稀释度做一个培养皿。

然后在每皿中倒入已溶化并冷至 50 C 左右的高氏一号培养基 15~20ml 左右，待冷凝成平板。

用无菌吸管从浓度最小稀释液开始，每次吸取
0.1ml 加到一组相应编号（10-5
）的高氏一号平 板上（每次吸取前，吸管要在液体内吹吸几次） ，再依次将10-4的土壤稀释液加到相应平板上。

用 无菌刮棒（从浓度小的稀释液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀。

（4 ）平板划线法分离土壤中放线菌
取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基
10〜12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均 匀，
平放桌上，使其凝成平板。

然后在皿底用蜡笔划分 A 、 B 、C 、
D 几个区。

每组两个平板培养基。

将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在 火焰
旁将培养皿稍微打开。

在此同时，用环状接种针在 火焰旁取少
许10-2浓度的土壤稀释液，迅速送入培养皿 内，在平板培养基
的一边，作第 1次平行划线6〜7条， 针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方
法，作第 3次平行划线。

划线时，接 种针应与平板表面成 30°角左右。

不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。

（5） 培养
接种完毕，将平皿放入 28 C 恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。

（6） 挑菌落
待三种方法的平板长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌 种。

如果1■斜■线法2■曲线法3•专格法 4.放射法5”四格法
菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。

转种至斜面，菌种用牛皮纸包好，置C冰箱中保存。

准备实验内容：
无菌刮棒打火机酒精灯
无菌报纸包（1个） 99mL水/三角瓶（玻璃珠）5支移液管
3支9mL水的试管培养皿6套
枪头（1mL/0.1mL ）
高氏一号培养基 500mL （ 150mL三角瓶2个，200mL试管）
思考题：
1. 检查接种后培养物的生长情况和染菌情况。

2. 观察与记录以下内容。

大小形状边缘颜色表面代谢物种类
3. 如何区分放线菌和真菌、细菌？
放线菌菌落小而紧密、干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面
为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。

霉菌菌落的话应该是比较大的，可能是大而疏松也可能大而紧密，其他一些跟放线菌都差不多，比如都是颜色多种多样，与培养基紧密结合难于挑取。

但在气味上有很大差别，放线菌具有泥腥味，而霉菌具有霉味。

还有一点就是放线菌菌落周围琼脂平面会有变形的现象。

若稀释平板的稀释度不够，放线菌会被抑制了或者菌落太小，而其他细菌的菌落又太多，不容易找到。

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