五、实验步骤
（二）蛋白含量测定
1. 制作标准曲线 按照下表操作，以A500nm为纵坐标，以蛋白含量为横坐标建立标曲。 2. 测定提取第2步稀释后样品的蛋白浓度 按上表中样品列操作，根据A500nm查找含量，并计算原始浓度。
试管 试剂 ml 标准 BSA 蒸馏水 Folin—酚试剂甲 Folin—酚试剂乙 A500nm 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 各 4ml 混匀后静置 10min 各 0.5ml 混匀后静置 30min 0.000 0.5ml 0.1(稀释 50 倍后) 0.4 4ml 1 2 3 4 5 6 样 品
五、实验步骤
（一）蛋白提取
1.称取3克大豆干粉，加入0.2%NaOH 30毫升。（先加入调成糊状，再用 少量多次地慢慢地加入（边加边搅拌），室温下搅拌抽提10min，于 4000r/min离心7min ,小心留取上清液，弃脂层和沉淀，如上清液有漂浮物， 再经过滤； 2. 留出上清液2毫升稀释50倍做含量测定（第二步） 3.制干粉：
每次使用前，将50ml（1）olin—酚试剂乙 （用前稀释一倍）
在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4•2H2O）,25克钼 酸钠（Na2MoO4•2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸， 100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结
植物蛋白质的提取和含量测定
一、实验目的
掌握大豆蛋白的提取及制备大豆蛋白
丙酮干粉的方法。
二、实验原理
1. 大豆蛋白主要是酸性蛋白，pI 4.5-5.0，能溶于碱溶液
本实验先利用稀碱提取大豆蛋白，再利用丙酮结合等电点溶解度最低 原理沉淀蛋白。 2. Folin-酚法测定蛋白质含量 酚试剂由两部分组成，试剂A为双缩脲试剂，可与肽链发生显色反应， 试剂B中的磷钼酸和磷钨酸在OH-条件下不稳定，易被酚类化合物还 原显蓝色，因蛋白质中含Tyr被还原成蓝色，颜色深浅与浓度成正比，
可用比色法测定。
三、实验器材
1.分光光度计（500nm），比色皿 2.计算纸（9 cm×9 cm）
3.离心机 （离心管100ml 、50ml）
4.组织捣碎机 5.精密pH试纸pH 0.5-5.0; pH 4.5-7.0
四、实验试剂
1.大豆干粉 2. 0.2%NaOH 3. 丙酮 （预冷） 4. 6M HCl，1M HCl 5 标准 BSA（0.5 mg/ml） 6. Folin—酚试剂甲（用前组分一: 组分二 = 50:1） （1） 1克 Na2CO3和0.2克 NaOH溶解于50毫升蒸馏水中。 （2） 0.5克硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解100毫升 1%酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6•4H2O）中。
束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，
开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈 绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕
色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当
稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
量剩余上清液的体积，加入等体积预冷丙酮，先用6mol/L的HCl调pH
至6.0，再用1mol/L的HCl小心调pH至4.5-5.0，于4000r/min离心15min， (留取沉淀物)，并用少量丙酮反复(至少两次)搅拌洗涤（在离心管中进行）， 加入丙酮后一定将沉淀搅拌充分，使沉淀脱水。得到白色粉末状的大豆蛋白粉， 用干净的滤纸吸干、平铺在表面皿上，放入40度烘箱干燥，待整个实验结束 后，再称重并计算产率（即3克大豆干粉中蛋白含量）。