华中科技大学硕士学位论文SMCC法抗体定向偶联技术的优化与应用研究姓名：冯燕申请学位级别：硕士专业：生物医学工程指导教师：杨祥良2011-05-24华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文摘要蛋白质偶联技术是采用一定的技术手段将具有生物活性的蛋白质与其它载体分子或标记物结合在一起的一种方法，在生命科学和医学领域有着广泛的应用。
在标记免疫分析方法中，抗体与酶等标记物的偶联效果会直接影响到免疫方法的灵敏度和可靠性。
常用的偶联方法如戊二醛法、碳二亚胺法、过碘酸钠氧化法法等不可避免地会产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使偶联效率降低、结合物活性减弱。
在此基础上发展起来的异性双功能偶联剂虽然可以克服这一不足，但酶在抗体上的连接位点具有随机性，导致抗体和酶的活性会受到影响。
因此，在实际应用中，需建立一种能定向偶联的抗体偶联技术。
本研究采用SMCC法，研究优化了免疫球蛋白IgG与辣根过氧化物酶HRP的偶联条件，主要研究内容包括：1) 采用体内诱生腹水法制备氯霉素单克隆抗体，并对其活性进行测定，建立竞争曲线。
2) 从投料比、反应温度、反应时间三个方面对抗体的DTT还原反应过程进行了研究，探讨了还原条件对免疫球蛋白的结构、活性等方面的影响。
3) 采用SMCC法将抗体与HRP偶联，并对其活性进行鉴定，并将其用于酶联免疫吸附实验。
研究结果表明，DTT还原反应的温度和时间对抗体结构和活性影响不大，而DTT 的加入量则有明显影响：在封闭巯基的条件下，投料比小于为600时，还原产物以大分子片段居多，当投料比大于600后，产物主要为小分子片段，且抗体活性开始下降，到6000时活性几乎完全丧失；在未封闭巯基条件下，由于游离巯基会重新聚合，当投料比在600～12000之间，抗体活性与产物的组成差异均不明显。
在将其应用于羊抗小鼠二抗与HRP的偶联中，确定优化的SMCC法偶联条件为DTT与抗体华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 投料的比为8000，反应温度为25℃，反应时间在20～30min。
关键词：定向偶联，抗体，SMCC，DTT华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文AbstractThe ability to conjugate a protein to another carrier or molecule has been widely used in life science research and medical science. In immunoassay, the conjugation of antibody and enzyme will directly effect sensitivity and reliability of the method.Present methods, such as glutaraldehyde-modified,EDC-modified and sodium periodate-oxidized, have inevitably formed much polyer, reduced the efficiency and decreased activity of the conjugation. Heterobifunctional conjugation reagents like SPDP, MBS can overcome this shortage, but enzyme will crosslink somewhat randomly to nearly all parts of the antibody molecule,this in turn leads to an influence of antibody and enzyme.So we must establish a site-directed conjugation schemes for application.This research conjugating condition of IgG and HRP was studied and optimized making use of SMCC-modified.In this research,monoclonal antibody was produced by immuning asctic fluid,the activity and titer of antibody was determined by ELISA,and the competition inhibition curve was established. The DTT reduction reaction of IgG has been studied from feed ratio,reaction temperature,reaction time,and investigate its influence on the structure,activity of immunoglobulin. HRP has been conjugated with antibodies using SMCC as a crosslinking reagent,which would be used in ELISA.The results showed that reaction temperature and reaction time have little effect on the structure and activity of immunoglobulin,but there is notable effect on them if we change the feed ratio.In the condition of blocking free sulphydryl, the activity of antibody begin to decline when the feed ratio is 600, and the activity is almost completely loss of when the feed ratio is 6000; but the free sulphydryl would re-aggregation if we do not block it, then the difference of structure and activity of antibody are not obvious when the华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文feed ratio is between 600～12000. Finally, we determined that the feed ratio is 8000, reaction time is between 20～30min, reaction temperature is 25℃.Key words: site-directed conjugation, antibody, SMCC, DTT华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文缩略词FBS 胎牛血清DMSO 二甲基亚砜BSA 牛血清白蛋白IgG 免疫球蛋白γ-globulin 牛源γ-球蛋白GAM 羊抗小鼠IgGHRP 辣根过氧化物酶GSH 谷胱甘肽IAAm 碘乙酰胺OV A 卵清蛋白ELISA 酶联免疫吸附实验CAP 氯霉素DTT 二硫苏糖醇DTNB 5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)SMCC 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
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（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文1. 绪论1.1 蛋白质偶联技术的发展蛋白质偶联是指将小分子物质（如药物、半抗原）或大分子物质（如酶、蛋白毒素等）以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物，抗体靶向药物和免疫毒素等[1]。
蛋白质偶联技术在生物学和医学领域得到越来越广泛的应用。
蛋白质偶联方法首先发展于人工抗原的制备研究，Landsteiner等[2]第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质（半抗原）如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体分子共价结合，使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于免疫分析等。
为了使免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对蛋白质偶联的方法进行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等偶联技术。
近10年来发展起来的酶标免疫检测技术，要求制备保持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶-抗体偶联物。
常用的偶联方法如戊二醛法、碳二亚胺法等不可避免的产生酶或抗体的自身交联或多聚物，致使偶联效率降低，结合物活性减弱。
为了克服这一不足，人们发展了异性双功能偶联试剂，如N-羟基琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯，以实现控制偶联，提高偶联反应的选择性和偶联产物的均一性。
将药物与大分子载体连接，制备药物-载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。
这是现代药物研究领域一个崭新的分支。
载体药物必须能够在体内定量、定位释放原型药物，以此要求设计pH敏感或特定酶敏感的偶联键。
导向药物的发展对蛋白质偶联方法提出了更高的要求。
早在1906年，Ehrlich就提出靶向给药的设想。
随着生物医学的发展，这一设想不断得到具体的实现。
单克隆抗体作为导向载体的出现，更使导向药物的研究成为当代药物研究中最活跃和最华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文引人注目的领域之一，而其中研究最广泛的是用于肿瘤治疗的抗体导向研究。