邻二氮菲分光光度法测定试样中的微量铁一、实验目的1．掌握邻二氮菲分光光度法测定微量铁的方法原理2．熟悉绘制吸收曲线的方法，正确选择测定波长3．学会制作标准曲线的方法4．通过邻二氮菲分光光度法测定微量铁，掌握721型分光光度计的正确使用方法，并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理邻二氮菲（phen ）和Fe 2+在pH3~9的溶液中，生成一种稳定的橙红色络合物Fe(phen)2+3，其lg K =21.3，ε508=1.1×104 L·mol -1·cm -1，铁含量在0.1~6μg·mL -1范围内遵守比尔定律。

显色前需用盐酸羟胺或抗坏血酸将Fe 3+全部还原为Fe 2+，然后再加入邻二氮菲，并调节溶液酸度至适宜的显色酸度范围。

有关反应如下：HCl OH NH 2Fe 223⋅++ ==== 22N Fe 2++↑+ 2H 2O + 4H + + 2Cl - N N Fe 2++ 3NN Fe 32+用分光光度法测定物质的含量，一般采用标准曲线法，即配制一系列浓度的标准溶液，在实验条件下依次测量各标准溶液的吸光度A ，以溶液的浓度C 为横坐标，相应的吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。

在同样实验条件下，测定待测溶液的吸光度Ax ，根据测得吸光度值Ax 从标准曲线上查出相应的浓度值Cx ，即可计算试样中被测物质的质量浓度。

三、仪器和试剂1．仪器 721型分光光度计，1 cm 比色皿。

2．试剂（1）100 µg ·mL -1铁标准储备溶液。

（2）100 g ·L -1盐酸羟胺水溶液。

用时现配。

（3）0.1% 邻二氮菲水溶液。

避光保存，溶液颜色变暗时即不能使用。

（4）pH=5.0的乙酸-乙酸钠溶液。

四、实验步骤1．显色标准溶液的配制 在序号为1~6的6只50 mL 容量瓶中，用吸量管分别加入0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL 铁标准使用液（含铁约100µg·mL -1），分别加入1.00 mL 100 g ·L-1盐酸羟胺溶液，摇匀后放置2 min ，再各加入5.0 mL 乙酸-乙酸钠溶液，3.00 mL 0.1% 邻二氮菲溶液，以水稀释至刻度，摇匀。

2．吸收曲线的绘制 在分光光度计上，用1 cm 吸收池，以试剂空白溶液（1号）为参比，在480~540 nm 之间进行扫描，测定待测溶液（如5号）的吸光度A ，得到以波长为横坐标，吸光度为纵坐标的吸收曲线，从而选择测定铁的最大吸收波长λmax 。

3．标准曲线的测绘 以步骤1中试剂空白溶液（1号）为参比，用1 cm 吸收池，在选定波长下测定2~6号各显色标准溶液的吸光度。

以铁的浓度(µg.mL -1)为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

4．铁含量的测定 移取试样溶液（7号）1.5mL,按步骤1显色后，在相同条件下测量其吸光度Ax ，由标准曲线上查出对应的Cx ，再进一步计算试样中微量铁的质量浓度C Fe 。

150.0()1.5Fe Cx mL C g mL mLμ-⨯=⋅ 五、数据记录与处理1．以吸光度为纵坐标，波长为横坐标，绘制吸收曲线，找出最大吸收波长λmax ，并计算其εmax 。

2．以吸光度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

然后，根据试样吸光度在标准曲线上查出相对应的浓度值，计算出试样中铁的含量（µg ·mL -1 ）。

六、思考题1．用邻二氮菲测定铁时，为什么要加入盐酸羟胺？2．吸收曲线与标准曲线有何区别？在实际应用中有何意义？3．测绘标准曲线和测定试液时，为什么要以试剂空白溶液为参比？紫外分光光度法测定水中总酚的含量一、实验目的1．掌握紫外分光光度法测定酚的原理和方法。

2．掌握应用紫外分光光度计进行定量分析的方法和基本操作。

二、实验原理苯酚是工业废水中的一种有害物质，如果流入江河，会使水质受到污染，因此在检测饮用水的卫生质量时，需对水中酚含量进行测定。

苯具有环状共轭体系，由 π→π*跃迁在紫外吸收光区产生三个特征吸收带：强度较高的E1带，出现在180nm 左右；中等强度的E2带，出现在204nm 左右；强度较弱的B 带，出现在255nm 。

有机溶剂、苯环上的取代基及其取代位置都可能对最大吸收峰的波长、强度和形状产生影响。

具有苯环结构的化合物在紫外光区均有较强的特征吸收峰，在苯环上的部分取代基（助色团）使吸收增强，而苯酚在270nm 处有特征吸收峰，在一定范围内其吸收强度与苯酚的含量成正比，符合Lambert-Beer 定律，因此，可用紫外分光光度法直接测定水中总酚的含量。

三、仪器与试剂UV2300型紫外可见分光光度计，石英比色皿（1cm ）2 个，50mL 容量瓶，移液管等。

苯酚标准溶液250 mg ·L -1：准确称取0.0250g 苯酚于250mL 烧杯，加20mL 去离子水溶解，移入100mL 容量瓶，用去离子水定容至刻度，摇匀。

四、实验步骤1．标准系列溶液的配制取5只50mL 容量瓶，分别加入2.00，4.00，6.00，8.00，10.00mL 浓度为250 mg ·L-1的苯酚标准溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀。

计算其浓度（mg ·L -1）。

2．吸收曲线的测定取上述标准系列中的任一溶液，用1cm 石英比色皿，以溶剂空白（去离子水）作参比，在220～350nm 波长范围内，扫描绘制吸收曲线。

3．标准曲线的测定选择苯酚的最大吸收波长（λmax ），用1cm 石英比色皿，以溶剂空白（去离子水）作参比，按浓度由低到高顺序依次测定苯酚标准溶液的吸光度。

4．水样的测定在与上述测定标准曲线相同的条件下，测定水样的吸光度。

五、数据记录与处理1．以吸光度为纵坐标，波长为横坐标绘制吸收曲线，找出最大吸收波长λmax，并计算其εmax。

2．以吸光度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

然后，根据水样吸光度在标准曲线上查出相对应的浓度值，计算出水样中苯酚的含量（g·L-1）。

六、思考题1．紫外分光光度法与可见分光光度法有何异同？2．紫外分光光度计与可见分光光度计的仪器部件有什么不同？3．在用分光光度计进行定量分析时，哪些操作可能影响测定结果的准确性？荧光素的分子荧光光谱一、实验目的1．了解仪器的性能与结构；熟悉仪器的操作步骤2．学会绘制激发光谱和荧光谱图（即确定最大的λEX和λEm）二、实验原理荧光素的化学式为C20H12O5，其稀溶液有很强的荧光。

在低浓度时，荧光强度与荧光物质量浓度呈正比：I f=kC三、仪器与试剂仪器：日本日立公司F-4500型荧光分光光度计。

试剂： 5×10-4mol·L-1荧光素储备液（称取0.01660g荧光素，先用50ml无水乙醇溶解再转移定容100ml容量瓶，实验时稀释100倍）四、实验步骤1．实验溶液的配制取1只100 mL容量瓶，加入1.00mL荧光素储备液（5×10-4mol·L-1），稀释至刻度，摇匀；2．绘制激发光谱和荧光发射光谱取2.00mL上述溶液至比色皿，将λEX固定在250 nm,选择合适的实验条件,在300~600 nm 范围内扫描即得荧光发射光谱(可排除λEX的干扰)，从谱图找出最大λEm值；将λEM固定在450 nm,选择合适的实验条件,在200~400 nm范围内扫描即得荧光激发光谱(可排除λEM的干扰)，从谱图找出最大λEX值.四、数据记录保存所测得的激发光谱和荧光发射光谱，并找出最高峰处所对应的波长和荧光值。

五、思考题1．如何绘制激发光谱和荧光发射光谱？2．哪些因素可能会对荧光素荧光产生影响？附1：721分光光度计使用操作指南721型分光光度计允许的测定波长范围在360～800nm，其构造比较简单，测定的灵敏度和精密度较高。

因此，应用比较广泛。

721型分光光度计操作方法：（1）仪器的电源开关接通（接220V交流电），打开比色槽暗箱盖，使电表指针处于“0”位，预热20分钟后，再选择需用的单色光波长和相应的放大灵敏度档，用调零电位器校正电表“0”位。

（2）将仪器的比色槽暗箱合上，比色槽座处于蒸馏水校正位子，使光电管见光，旋转光量调节器调节光电管输出的光电讯号使电表指针正确处于100%。

（3）按上述方式连续几次调正“0”位和电表指针100%，仪器即可进行测定工作。

（4）待测溶液置于比色皿中，依次放入试样架的吸收池；（5）打开样品室盖调零点，合上样品室盖调参比，反复2～3次；（6）其它比色皿依次推入光路中，读取吸光度值。

721型分光光度计使用和维护中应注意事项：（1）仪器尚未接通电源时，电表的指针必须位于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。

（2）放大器灵敏度有五档，应逐步增加，“1”最低，其选择原则是保证使空白档刚好调到“100”的情况下，尽可能采用灵敏度较低档，这样仪器将有更高的稳定性。

所以使用时一般置“1”，灵敏度不够时再逐渐升高，但改变灵敏度后须按第2项重新校正“0”和“100%”。

（3）如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100%”后，稍等片刻，（钨灯在急剧改变亮度后需要一段热平衡时间），当指针稳定后重新调整“0”和“100%”即可工作。

（4）根据溶液中的被测物含量的不同可以酌情选用不同规格光程长度的比色槽，目的是使电表读数处于0.8吸光度值之内。

（5）连续使用仪器的时间不应超过2小时，最好是间歇0.5小时后，再继续使用。

（6）仪器不能受潮。

在日常使用中，应经常注意单色器上的防潮硅胶(在仪器的底部)是否变色，如硅胶的颜色已变红，应立即取出烘干或更换。

（7）在托运或移动仪器时，应注意小心轻放。

比色皿使用注意事项：（1）拿取比色皿时，手指不能接触其透光面；（2）装溶液时，先用该溶液润洗比色皿内壁2～3次；测定系列溶液时，通常按由稀到浓的顺序测定；（3）被测溶液以装至比色皿的3/4高度为宜；（4）装好溶液后，先用滤纸轻轻吸去比色皿外部的液体，再用擦镜纸小心擦拭透光面，直到洁净透明；（5）一般参比溶液的比色皿放在第一格，待测溶液放在后面三格；（6）实验中勿将盛有溶液的比色皿放在仪器面板上，以免玷污和腐蚀仪器，实验完毕，及时把比色皿洗净、晾干，放回比色皿盒中。

（7）比色皿每次使用完毕后，要用去离子水洗净并倒置晾干后，存放在比色皿盒内。

在日常使用中应注意保护比色皿的透光面，使其不受损坏或产生划痕，以免影响透光率。

附2：UV2300型紫外可见分光光度计使用操作指南1、开机确认仪器比色池为空，打开主机电源，预热15min。

开启电脑，启动桌面的“UV Solutions 2.0”控制软件，进入界面。