血栓动物模型的建立首都医科大学病理解剖学教研室 刘 瑜3 董小黎 正常情况下,血液之所以能在血循环内呈液体状态,是由于机体存在着相互拮抗的凝血和抗凝血系统。
由于物理、化学、创伤、感染、免疫和代谢等因素造成凝血和抗凝血系统的功能紊乱,可导致血栓形成。
血栓形成涉及心血管内皮、血流状态和凝血反应3方面的改变[1]。
首先,血管内皮受损是血栓形成最重要的因素,内皮细胞损伤后,内皮下胶原纤维暴露,与血小板膜相互作用使得血小板活化。
各种不同的黏附蛋白分子如血管性血友病因子(vWF)和纤黏蛋白(FN)可富集在损伤区域。
其中vWF主要由血管内皮细胞合成,是血小板在基质或血管基底膜的主要黏附蛋白。
vWF可与血小板膜糖蛋白G p Ib/Ⅸ复合物结合,也可与活化血小板膜上的整和素αⅡbβ3结合。
它也含有与胶原和内膜下基质内糖胺聚糖的结构域,因此它通过架桥作用,促进血小板黏附,启动凝血过程,导致血栓形成。
其次,血流缓慢或有涡流时,血小板进入边流,黏附于内膜的可能性大为增加,同时凝血因子也容易在局部堆积和活化而启动凝血过程。
涡流产生的离心力和血流缓慢,都会损伤内皮细胞,使其产生的内皮细胞合成前列腺环素(P GI2)和组织型血浆素原活化因子(t PA)等物质减少,从而抗血小板凝集、抗凝血和降解纤维蛋白的能力降低,也是导致血栓形成的原因。
另外,血液的高凝状态如DIC、手术、创伤、妊娠等引起的血液凝固性增高是血栓形成的又一原因。
这3种条件往往合并存在,但常以某一条件为主。
由于血栓性疾病的巨大危害性,对于血栓形成机制、血栓的诊断和抗血栓药的研究便显得尤为重要,因此建立简单、快速、价格低廉而实用的动物血栓模型对于血栓性疾病的研究是十分必要的。
本文对近年来较为常用的一些血栓动物模型加以介绍。
1 物理损伤法1.1 机械损伤法[2]原理:刮匙搔刮损伤血管内膜,使内皮下细胞外基质(ECM)裸露,促使血小板与ECM(主要是胶原纤维)接触而被激活和黏附。
同时裸露的胶原纤维激活Ⅻ因子以及损伤的内皮细胞释放出组织因子,启动了内源性和外源性凝血过程,导致血栓形成。
步骤:麻醉家兔后,分离其股深动脉,选择直径为1mm的股深动脉血管段,用微型血管夹夹住上下两端,使其中间留有1.5cm长的血管段为手术部位。
在实体镜下,用7号针头从血管段上端沿血管向下刺入血管段内并顺势注入生理盐水冲净血管内的血液,后抽出针头,再用6号微型刮匙沿刺破孔送入血管内,反复搔刮血管内膜。
搔刮深度以0.5～0.7cm为宜。
搔刮面积尽可能大些,以刮出少量血管内膜为宜。
稍等片刻,轻轻松动血管段远端血管夹,使血液充盈血管。
待刺孔不渗血时,取下血管段两端血管夹(不能自行止血时可用0号无损伤线缝合刺破孔一针)。
触摸家兔膝内侧皮下支动脉搏动示血管已通畅。
然后逐层缝合,关闭皮肤切口。
评价:此法依据血栓形成基本原理,在动物体内形成血栓,方法简便、易行,成功率100%,术后24h即开始有血栓形成,也可用于制备静脉血栓模型。
主要适用于:1)动态观察血栓形成过程中血栓形态及血栓变化规律的研究。
2)评价药物溶栓作用的实验研究。
3)与形成和溶解血栓有关的其他实验研究。
1.2 股动脉异物法[3]原理:股动脉内放置螺旋钢丝线圈,造成动脉内膜损伤,局部血流动力学改变,激活凝血系2002年 9月第23卷 第3期首都医科大学学报Journal of Capital University of Medical SciencesSep.2002Vol.23 No.3收稿日期:2001211214北京市卫生局基金资助课题 3首都医科大学2000级硕士研究生统,促血小板凝集、释放一系列活性物质,致血栓形成。
步骤:麻醉雄犬后,分离其股动脉约7cm,从股动脉远心端向近心端方向安插自制单股螺旋钢丝(直径0.5cm,长度1.5cm),进入血管内腔后,行血管缝合术,再用医用生物黏合胶黏合。
去动脉夹,确定血管再通充盈和手术视野无渗血,逐层缝合,术毕。
评价:此法可靠易行,重复性好,血栓由血小板、白细胞及纤维蛋白构成。
目前多用于血栓放射免疫显像方面的研究。
1.3 电流损伤法[4]原理:1.5mA直流电刺激颈动脉壁可使血管损伤,血管内膜变得粗糙不平,引起血小板黏附聚集及释放一系列活性物质,激活内源性凝血系统,同时受损内膜释放的组织凝血活素可激活外源性凝血系统,于是动脉管腔内逐渐形成肉眼可见的混合血栓。
步骤:麻醉大鼠后,颈部正中切口,剥离其右侧颈总动脉约15mm长,用小块塑料布遮盖伤口附近的组织,防止组织温度影响血管壁表面温度及刺激电极与周围组织接触。
刺激电极由2根直径为1.3mm,间距1.7mm的不锈钢棒组成,把刺激电极和温度探子钩于动脉内膜上。
电流用1.5mA,刺激时间为7min。
当血栓阻断血流后,远心端动脉温度骤降,记录从电刺激开始到温度骤降所需时间,称堵塞时间(occlusion time,O T),即为血栓形成时间。
评价:一般认为,动脉血栓产生的决定因素是内皮损伤及高切率血流(如狭窄),在高切率区血栓成分以血小板为主,而低切率区以纤维蛋白和红细胞为主[5]。
静脉血栓产生的决定因素是内皮损伤,血液淤积呈高凝状态,血栓主要成分是纤维蛋白、红细胞和少量的血小板及白细胞[6]。
此实验中形成的血栓成分在电刺激区以血小板及纤维蛋白为主,有少量红细胞及白细胞,而在电刺激远端以纤维蛋白及红细胞为主,所以1.5mA直流电刺激动脉壁形成的血栓在形态结构上与人类动脉血栓相似,有较好的可比性,适用于抗血栓形成药物的筛选,抑制血栓形成的药物能延长O T值。
此模型操作简单,但受动物年龄、环境温度等的影响较大,标准差较大,因而应用时有一定局限性。
1.4 结扎法[7,8]原理:粗丝线结扎下腔静脉,引起局部血流淤滞、缺氧,导致血管内皮细胞损伤,启动内源性凝血系统。
此外,黏聚的血小板与局部形成的凝血因子也因血流受阻停留在局部,致使血栓形成。
步骤:麻醉大鼠后,开腹,分离其下腔静脉,于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉,缝合腹壁,结扎2～6h重新打开腹腔,在结扎线下方2cm处夹闭血管,剖开管腔,取出血栓,60℃烘干后称量血栓质量,以血栓质量或血栓形成百分率为指标。
评价:一般在结扎后2h血栓形成率约为60%～80%,此时处死动物主要观察血栓形成百分率。
6h后血栓形成率为100%,此时应观察血栓质量。
此方法多用于判定溶栓药物的体内抗血栓作用。
2 化学损伤法2.1 胰蛋白酶血栓形成法[9,10]原理:胰蛋白酶具有蛋白水解作用,使血管内膜和部分肌层脱落,血小板黏附、聚集,致血栓形成。
步骤:麻醉家兔后,暴露右侧颈总动脉约2.5cm,用显微外科动脉夹夹住近心端和远心端,两端分别插入8号针头,于针头进入部位结扎血管,两结扎线相距1.5cm,经近心端针头用输液泵匀速(0.6mL/min)灌注1.0%胰蛋白酶15min。
随后以相同速度灌注生理盐水冲洗,灌注液经远心端排出,拔出针头并用无创伤性针线缝合针孔,打开动脉夹使血流复通。
评价:所形成的血栓富含血小板和纤维蛋白,类似于临床上动脉血栓的形成。
方法可靠,重复性好。
用于抗血栓药物的筛选和研究。
2.2 过氧化氢(H2O2)血栓形成法[11]原理:过氧化氢损伤血管内膜,引起血小板黏附聚集,致血栓形成。
步骤:家兔局麻后,分离其一侧颈总动脉,872首都医科大学学报第23卷以2个动脉夹夹闭此动脉,夹间距离约2.5 cm,用4号针头刺入动脉并固定,迅速抽出动脉段内残留血液,并以生理盐水反复冲洗3～4次至动脉段内无残血。
然后以10%H2O2溶液0.4mL分4～5次注入动脉段内连续作用10 min,再以生理盐水冲洗2～3次后,用黏合胶黏合针孔,放开血流。
评价:所形成的血栓以白色血栓为主,符合动脉血栓的特征,可以用来探索防止血栓形成的方法。
2.3 角叉菜胶血栓形成法[12]原理:角叉菜胶是从海藻中提取的含硫酸多糖物质[13],是一种较强的致炎物质,其诱发的尾动脉局部血栓与血管内炎症密切相关,炎症时释放的大量炎症介质,如白介素21、肿瘤坏死因子等可破坏正常内皮细胞维持凝血与纤溶之间的平衡作用,从而促发血栓形成;此外,内皮细胞损伤时舒血管物质如乙酰胆碱等分泌减少,缩血管物质如内皮素等增多,使局部血管痉挛,加重局部血管缺血缺氧状况,进一步促进血栓形成及血管内皮损伤。
步骤:昆明种雄性小鼠或SD雄性大鼠,角叉菜胶用生理盐水配制成0.1%和1%,皮下注射。
小鼠注射部位在腰背部,大鼠为后肢足跖部。
注射3～14h后,多数动物尾尖部出现暗红色血栓形成区,并逐渐向尾根部扩大。
48～72h后局部从发绀变为黑色,随后尾部干细断落。
评价:24h实验动物尾部小静脉和毛细血管内含有大量纤维素和少量白细胞及血小板,血管内皮细胞核浓缩呈骰子状,血管内壁中性粒细胞靠边。
72h可见较大血管呈炎症改变,伴有混合性血栓形成。
由于血栓发生在尾部,界限明显,可从体表观察血栓形成出现的时间与发展过程,测量其波及的范围或长度,可为研究体内血栓形成全过程提供一个简便、直观的动物模型。
2.4 三氯化铁(FeCl3)血栓形成法[14,15]原理:铁离子侵入血管壁造成血管内膜损伤,血小板黏附聚集,血栓形成。
步骤:大鼠麻醉后侧卧固定,自眼眦和外耳道中线处剪一切口,暴露及除去颧弓,再暴露颞前窝及鳞状骨大部分,然后在颧弓和鳞状骨前联合的前下方约2mm处钻孔,开一约2mm 直径的小颅窗,暴露大脑中动脉,置一小片塑料薄膜保护血管周围组织。
将吸有50%三氯化铁(FeCl3)溶液10μL的小片滤纸敷在该段大脑中动脉上20min,共敷2次后去掉滤纸。
再用生理盐水冲洗局部组织,逐层缝合。
评价:方法简单、可靠,重复性好,形成的动脉血栓成分为血小板、红细胞及纤维蛋白等,为混合血栓。
而且此方法仍保留有大脑中动脉,可进行血管观察,较接近于临床,且此模型既能反映抗栓药又能反映溶栓药的药效,用已知的抗栓药物阿司匹林和溶栓药物尿激酶均验证了这一点。
该模型还可以利用TTC染色技术直观地观察脑梗死程度。
其不足之处是动物的颧弓被去除,影响动物进食,不利于作长期观察等,此法还有待改进。
2.5 光化学法[16]原理:利用虎红B(四碘四氯荧光素钠)在单色绿光下产生并释放单态氧,使血管内皮细胞膜上的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,不仅使细胞膜的通透性改变,Ca2+内流增加,而且脂质过氧化物增加可破坏前列环素(P GI2)与血栓素B2(TX B2)的平衡,促进血小板聚集与黏附,激活凝血过程,形成血栓并进一步阻塞血管导致缺血;同时凝血过程中产生大量血管活性物质及神经毒性物质,破坏脑细胞尤其是血2脑脊液屏障,与人类脑梗死发生极为相似。
步骤:麻醉大鼠后,经左侧颞部入路,于左眼外眦和左耳外耳道连线上近眼外眦1/3处作一垂直的长约2cm的弧形切口,分离颞肌,去除颧弓,用拉钩拉开下颌关节,在卵圆孔前上方用牙科钻作一直径为5mm的骨窗,切开硬脑膜即可见大脑中动脉(MCA),选择MCA的近端(起始部)和从嗅束至大脑下静脉间的一段MCA为光照部位,自制L G2150B冷光源的光纤端口距离MCA表面血管约5mm,将光纤所射出的光束垂直对准MCA,光照分2步,首先将光纤移至MCA起始部,经股静脉注入1.5%972 第3期刘 瑜等:血栓动物模型的建立虎红B(2mL/kg)5min后,持续光照10min,然后将光纤移到嗅束至大脑下静脉段MCA血管表面,再注入半量虎红B,仍持续照射10 min,至此血栓模型制作完毕。