无限增殖的小鼠胚胎成纤维细胞系胰高血糖素样免疫反应的
建立及特性描述
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湖北师范学院生命科学学院生物科学专业 1101班 201111XXXXXXX
摘要
1.背景:
Hh信号是一种保守的形态形成通路,它在胚胎发育中扮演至关重要的角色,新兴的证据也支持这一角色在治疗和修复过程以及肿瘤发生中的作用。

胰高血糖素样免疫反应性家族的转录因子(Gli1,2和3)通过调节下游靶基因的表达来调解刺猬形态形成的信号。

我们以前用来自小鼠胰高血糖素样免疫反应性的一系列胚胎成纤维细胞来描述Gli蛋白在Hh目标基因调节中的个体与合作的角色。

2.结果:
本文中,我们描述了缺乏单个和多个Gli基因自发地无限增值的老鼠胚胎成纤维(iMEF)细胞系的建立。

这些非无性繁殖系的细胞系概括了独特的配体介导的转录响应早期的MEFs。

然而许多Gli1对目标基因的诱导不起作用,已发现的Gli2空细胞会减弱目标基因的感应而Gli3空细胞表现出提高基底部并促进配体诱导的表达。

在Gli1 - / 2 - / - iMEFs中的目标基因反应严重地降低而Gli2 - / 3 / - iMEFs 不能引发转录反应。

然而,我们发现Gli1 / 2 - / -和Gli2 / 3 - / - iMEFs对Hh配体都表现出强劲的白三烯依赖性的综合迁移,这证明了这种反应不是依赖性的转录。

3.结论:
本研究提供了一系列Gli-null iMEFs转录和非转录的Hh反应的基本特征。

向前推移,在Hh 反应程控中，这些细胞系被证明是一套有价值的工具，用来研究独特功能的调控。

背景
对于多种多样的生物过程，包括发育模式和器官形成，Hh信号通路是一个至关重要的调控子。

这条路径从上游的Hh配体结合起始，到跨膜转运受体的碎片蛋白(Ptc1)。

这减轻了碎片蛋白介导对Smoothened(Smo)的抑制,引发了复杂的下游信号级联(综述[1]]。

Gli1和Ptc1是保守的Hh目标基因并且其表达水平被认为是路径活动的可靠指标。

大多数Hh信号介导的生物学效应似乎都是通过Hh目标基因的转录调控被调节的,就连最近的一个非转录反应也被确定[2、3]。

在确定Hh在生长和组织与器官的形态发生中发放信号的角色时，空小鼠模型是至关重要的。

在探索在通路调节中个体Hh信号介质的功能时，这些模型也被证明是很有价值的。

在细胞分析中,Gli1的过度表达已经被发现可以诱导Hh目标基因的表达。

小鼠的Gli1 发育正常的这一发现,推断Gli1的功能对于正常发育是可有可无的[4]。

小鼠的Gli2 表现出神经管缺陷并且证明减退的Hh目标基因表达在几个组织中[5 - 7]。

它支持来自基于细胞分析的研究结果[8]，即把Gli2的功能作为一个关键的目标基因的激活剂。

对于Gli3空小鼠，在来自于野生型的器官中，增加的目标基因的表达暗示，Gli3的功能是抑制转录。

大量的研究已经利用转基因的MEFs来探究调查不同多种多样的基因和蛋白质的性质。

然而,用于实验的早期细胞受限于有限的增殖与培养期。

我们先前提出小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)来自Gli null小鼠的说法，提供了一个在数量上容易处理的细胞系统，这一系统是通过Gli 转录因子[11]来检验Hh目标基因的调控。

现在，我们描述无限增殖的Gli null MEFs(iMEFs) 的增殖并且描述它们的转录以及迁徙对Hh配体刺激做出反应的特性。

方法
1.动物
这项工作的进行得到了威斯康辛州的动物保健大学和使用委员会的批准。

Gli1zfd和Gli2zfd小鼠是Alexandra Joyner慷慨地提供的并且依靠一个远系繁殖的CD-1本底来供养。

Gli3Xtj小鼠由杰克逊实验室制得,并且依赖一个C57 /C3H的本底来供养。

早期的MEFs[11]来源于Gli1 zfd 和Gli2 zfd转基因小鼠和Gli3Xtj突变小鼠的杂交。

Gli1zfd和Gli2zfd转基因小鼠产生的同源重组取代外显子2 - 5和3 -5,分别与neo基因盒相对应(4、12)。

来自于杰克逊实验室的Gli3Xtj突变体小鼠,由于基因上3 '末端的缺失突变，导致Gli3不能表达。

2.细胞的无限增殖化
正如先前所描述(利平斯基et al .,2006)的，早期的MEFs被培养在含10%的胎牛血清的DMEM(FCS)（包含谷酰胺,4.5 g / L葡萄糖,而无丙酮酸钠）以及1% 的聚萘二甲酸乙二醇酯/链球菌的培养基中，并且随着3T3 细胞自发的无限增殖的流程来繁殖[14]。

在4.0毫升媒介中的3.0×105细胞都被涂在60
毫米的平板上并且每隔三天传代一次。

8 - 12天过后,扩散利率降低,在后面的传代之前，细胞被允许培养成覆盖的一层。

15 - 25天后,扩散速率增加,表明自发的无限增殖。

紧接着,细胞额外培养的10 - 12天是为了确保稳定的无限增殖。

Gli1、Gli2 Gli3在对应空iMEF细胞系中表达的缺失被分离的cDNA 的Real Time-RT-PCR[11]以及标准基因组DNA的基因型所证实。

(4、12)
3.通过逆转录病毒的基因传递使过度表达的细胞系稳定的增殖
4.细胞治疗以及及时的反转录PCR
5.细胞移行实验
结果与讨论
1.MEF无线增值化，形态特征和倍体分析
2.对于iMEF转录调节的Hh 反应性的特性描述
参考文献。