《细胞生物学实验》实验课程教学大纲一、课程基本信息课程名称：细胞生物学实验英文名称：Cell Biology Experiment课程性质：学科及专业基础课课程属性：独立设课适用专业：生物科学本科学时学分：课程共18学时；课程共1学分开设学期：第五学期先修课程：生物化学、细胞生物学二、课程简介细胞生物学实验课程是生命科学本科各专业的一门必修基础课程，在生命科学的本科教学中有着十分重要的地位。
课程内容包括基础验证性，基本技能性实验，以及综合性、研究设计性实验四大类。
基础验证性和基本技能性实验主要是配合理论课的教学，使学生加深理解和掌握有关理论知识，同时能够规范地掌握细胞生物学研究的基本操作与基本的实验技能。
综合性、研究设计性实验，目的旨在培养和提高学生实验设计和应用各种实验技术的能力，培养和训练学生的创新意识和创新能力，培养严谨的科学态度和实事求是的作风，提高发现问题、分析问题和解决问题的能力，为今后独立从事科学研究打下坚实的基础。
三、实验课程目的与要求1、学习本门课程的目的：配合理论课教学，巩固所学知识；掌握细胞生物学研究的相关技术，学习先进的研究方法；通过综合性、研究设计性实验，培养学生的实验设计能力，实验动手能力以及文献查阅、论文写作能力；培养学生的科学思维方法，提高发现问题、分析问题和解决问题的能力。
2、学习本门课程的要求：要求学生掌握基本的实验操作技能，掌握基本的实验设计思路；要求学生以个人或小组的形式根据自己所学知识、兴趣设计研究课题进行实验，期末要提交完整的实验报告；要求学生通过研讨会、交流会的形式，将实验过程中遇到的各种问题进行探讨，让每个同学都有发表个人见解的机会，从而达到集思广益，提高自主学习的能力。
四、考核方式：1、实验报告：实验报告应包括实验目的，实验原理，实验用品，实验步骤(如果指导书上有实验步骤，可以简单梳理步骤或省略此步)，实验结果，结果讨论，有时还要求做思考题。
2、实验课的考核方式和成绩评定办法：实验课的考核方式以实验操作考查为主。
实验课成绩评定可分为三个部分：出勤率、实验态度占总成绩10%；操作能力及实验报告撰写情况占总成绩60%；实验设计（包括实验的思路、论文撰写、课堂讨论）占总成绩30%。
五、实验项目、学时分配情况序号实验项目名称实验学时实验类型实验要求实验一细胞形态结构与细胞器的显微观察4学时验证性实验必做实验二细胞培养以及冷冻复苏技术5学时综合性实验必做实验三细胞膜的渗透性观察3学时验证性实验选做实验四细胞融合技术（PEG法）4学时综合性实验选做实验五细胞骨架的显示与观察4学时验证性实验选做实验六细胞生理活动的观察5学时综合性实验选做5学时综合性实验选做实验七细胞组分分离技术及细胞组分的化学反应实验八精子细胞生物学特性分析5学时设计性实验选做实验九叶绿体分离及离体叶绿体4学时验证性实验选做的还原活性合计实验个数：9 合计学时数：39学时六、实验内容实验一细胞形态结构与细胞器的显微观察目的要求：1、熟悉动植物细胞的基本形态结构，在普通光学显微镜下识别细胞器的形态结构，掌握生物绘图的方法。
2、制备不同细胞的临时制片，学会使用测微尺测量红细胞。
3、掌握细胞活体染色方法，了解显微镜下液泡和线粒体基本形态结构。
实验内容：1、显微镜下观察不同细胞的形态结构与几种细胞器的形态和分布。
2、液泡系和线粒体的活体染色。
3、学习正确的生物绘图方法。
主要仪器设备药品：配有目镜测微尺的显微镜，载玻片，盖玻片，吸水纸，手术器械，解剖盘，培养皿，一次性采血针，牙签，离心机，天平，10ml注射器，甲苯胺蓝，甲基蓝，Ringer氏液（两栖类、哺乳类），詹纳斯绿B染液，中性红染液。
计划时数：4学时实验类型：验证性实验实验性质：必做每组人数：1人实验二细胞培养以及冷冻复苏技术目的要求：1、学习动物细胞原代培养和传代培养的基本操作，熟练掌握无菌操作技术。
2、学会正确的细胞冷冻复苏技术，提高细胞的存活率。
3、学会细胞DMEM培养基的配制及无菌过滤。
实验内容：1、配制DMEM培养基，熟悉培养基的主要成分，以及血清的灭菌方法。
2、原代培养细胞：乳兔脱颈椎处死后，无菌操作取出肝脏或肾脏。
消化、接种培养到培养皿中。
3、Hela细胞的传代培养：胰酶消化细胞，培养基混悬细胞，离心后将部分细胞转移到新的培养皿中。
4、细胞冻存：了解细胞冻存的原理。
配制细胞冻存液，将细胞逐步降温，最后将细胞置于液氮罐中。
5、从液氮罐中取出细胞水浴复苏，待细胞贴壁后计算细胞成活率。
主要仪器设备药品：二氧化碳培养箱，倒置显微镜，超净工作台，冰箱，液氮罐，液氮瓶，离心机，超低温冰箱，高压灭菌锅，酒精灯，烧杯，恒温水浴箱，1.5ml离心管，培养皿，培养瓶，手术器械，1ml、200μl、10μl微量移液器，HeLa细胞株，滤器，滤膜，DMEM培养基，小牛血清，PBS缓冲液，胰蛋白酶，EDTA，乙醇。
计划时数：5学时实验类型：综合性实验实验性质：必做每组人数：2人实验三细胞膜的渗透性观察目的要求：1、了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
2、了解溶血现象及其发生机制。
实验内容：1、杀鸡取血5ml（防止污染），放入盛有20ml Alsever’s溶液的瓶中，混匀后备用。
2、使用前，取用Alsever’s溶液保存的新鲜鸡血5ml，加入8ml的0.128 mol/L 的NaCl溶液，小心混匀，1000 r/min离心5min，如此3次洗涤，最后配成30%的鸡红细胞悬液。
3、取11支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各3ml，作出标记后，各管均加入红细胞悬液2滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。
主要仪器设备药品：普通显微镜，离心机，扭力天平，10ml试管，试管架，15ml刻度离心管，超净操作台，高压灭菌锅，冰箱，2ml注射器，5ml移液管，洗耳球，滴管，小烧杯，载玻片，擦镜纸，记号笔，葡萄糖，柠檬酸钠，柠檬酸，氯化钠，蒸馏水（调PH至7.2），氯化铵，醋酸铵，硝酸钠，葡萄糖。
计划时数：3学时实验类型：验证性实验实验性质：选做每组人数：4人实验四细胞融合技术（PEG法）目的要求：掌握细胞融合原理，学习应用PEG(聚乙二醇)为介导物融合细胞的方法，计算细胞融合率。
实验内容：1、细胞准备。
取新鲜鸡血以0.85%生理盐水制成10%的悬液后备用。
2、制备50%的PEG促融合液，让鸡红细胞在37°水浴中发生融合。
3、显微镜下观察细胞融合情况，并计算融合效率。
主要仪器设备药品：普通显微镜，离心机，水浴锅，15ml刻度离心管，试管，载玻片，盖破片，5ml移液管，聚乙二醇(PEG)，氯化钠，氯化钾，碳酸氢钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，氯化钙，氯化镁，硫酸镁，葡萄糖。
计划时数：4学时实验类型：综合性实验实验性质：选做每组人数：4人实验五细胞骨架的显示与观察目的要求：1、掌握细胞骨架的光学显微镜标本的制作原理及方法。
2、观察植物细胞骨架的基本形态结构。
实验内容：1、制片。
撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干，加入pH6.8磷酸缓冲液使其下沉。
去掉磷酸缓冲液，用1％Triton X—100处理20min。
去掉TritonX—100，用M 缓冲液洗3次后，再用3％戊二醛固定30min，磷酸缓冲液洗3次。
0.2%考马斯亮蓝R250染色10min，蒸馏水洗2次2、样品观察。
将样品置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。
3、保存。
如果染色效果好，则可依次用50％乙醇，70%乙醇，95％乙醇，正丁醇，二甲苯处理样品，各5min，然后将样品平展于载玻片上，加一滴中性树胶，盖上盖玻片封片，制成永久切片。
主要仪器设备药品：普通显微镜，烧杯，镊子，载玻片，盖破片，滴管，中性树脂或甘油，戊二醛，Trion X-100，考马斯亮蓝R250染色液，无水乙醇，冰醋酸，咪唑，氯化钾，氯化镁，乙二醇，醚四乙酸，乙二胺四乙酸，巯基乙醇，正丁醇，二甲苯。
计划时数：4学时实验类型：验证性实验实验性质：选做每组人数：4人实验六细胞生理活动的观察目的要求：通过制片与观察加深理解细胞的运动、吞噬等生理活动。
实验内容：1、小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察。
实验前向小鼠腹腔注射淀粉肉汤，以刺激腹腔产生较多的巨噬细胞。
实验时取经上述处理的小鼠，腹腔注射鸡血悬液后，脱颈椎处死小鼠，抽取腹腔液，镜检观察并画图记录。
2、观察蟾蜍上颌粘膜上皮细胞的纤毛运动。
双毁髓处理蟾蜍，剪取其咽头前部的上颌粘膜一小块，将纵切面贴于载玻片上镜检，观察纤毛运动。
主要仪器设备药品：l％鸡血悬液，6％淀粉肉汤，草履虫，普通显微镜，暗视野显微镜，2ml 注射器，载玻片，盖玻片，解剖器材，滴管，移液管，试管，玻璃板，黑纸，台盼蓝，刚果红。
计划时数：5学时实验类型：综合性实验实验性质：选做每组人数：4人实验七细胞组分分离技术及细胞组分的化学反应目的要求：1、掌握细胞匀浆制备和差速离心方法，了解细胞组分逐级分离的原理和基本过程。
2、了解核酸、蛋白质、糖及酶的细胞化学反应原理，掌握Brachet反应及碱性蛋白、酸性蛋白、糖原和过氧化物酶的细胞化学染色方法。
实验内容：1、研磨法或超声波法制备细胞匀浆，通过差数离心技术初步分离得到细胞核、线粒体等主要细胞器，染色鉴定。
2、Brachet化学反应显示细胞内的DNA和RNA，观察细胞内这两种遗传物质的分布。
3、细胞内酸性蛋白和碱性蛋白的显示，三氯醋酸处理细胞，观察不同蛋白的分布。
4、细胞内过氧化物酶的显示，以及过碘酸雪夫反应(PAS)显示细胞内糖原。
主要仪器设备药品：光学显微镜，解剖器材，高速离心机，蜡盘，电子天平，恒温水浴箱，冰箱，肝脏石腊切片，Hela细胞，载玻片，盖玻片，吸水纸，染色缸，PH测量计，PBS 缓冲液(pH7.2)，甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液、丙酮，二甲苯，乙醇，三氯醋酸，碱性固绿，酸性固绿，硫酸铜，联苯胺混合液，番红，过碘酸酒精液，Schiff氏酒精液，亚硫酸水，苏木精，甲醇，冰醋酸。
计划时数：5学时实验类型：综合性实验实验性质：选做每组人数：2人实验八精子细胞生物学特性分析目的要求：1、观察动物精子细胞在显微镜下的运动活性，学会计算精子活动率和活力。
2、设计方案研究了不同水体、盐度(NaCl溶液)和pH对精子活力的影响。
3、掌握精子细胞的冷冻与复苏技术。
实验内容：1、采集动物精细胞，制备稀释液，在普通显微镜下观察精子的形态结构，以及精子细胞的运动活性，并绘图。
2、瑞-吉染色法和考马斯亮蓝染色法对形态正常精子进行标记，并计算精子活力和活动率，评价精子质量。
3、设计实验，分别探索精子激活以及抑制时的最佳渗透压、离子浓度、和pH值。
4、学习精子细胞的冷冻复苏与常规细胞冻存复苏的异同点。
主要仪器设备药品：倒置显微镜，不锈钢保温瓶，离心机，电子天平，恒温水浴箱，超低温冰箱，精子细胞，载玻片，盖玻片，吸水纸，染色缸，PH测量计，PBS缓冲液(pH7.2)，氯化钠，新生牛血清，DMSO，瑞-吉染料，考马斯亮蓝，氢氧化钠、盐酸。