第18卷第3期分析测试学报Vo l.18N o.31999年5月FENXI CESHI XUEBAO(J ou rnal of Instrum ental Analy sis)M ay1999硒酵母中有机硒及硒代氨基酸含量的测定方法郝素娥滕冰(哈尔滨工业大学应用化学系哈尔滨150001)(东北农业大学分析测试中心哈尔滨150030)摘要报道了人工培养硒酵母中有机硒及硒代胱氨酸(S eC y s)和硒代蛋氨酸(SeM et)含量的测定方法。
采用透析处理法使硒酵母中的无机硒和有机硒得以分离,并采用催化分光光度法测定了硒酵母中有机硒的含量;采用氨基酸自动分析仪测定了硒酵母中S eCy s和SeM et的含量。
关键词硒酵母,有机硒,硒代胱氨酸,硒代蛋氨酸硒是生物体必需的微量营养元素,缺硒会导致很多疾病。
人体缺硒会诱发心血管疾病和癌症;动物缺硒会导致白肌病和生长缓慢等。
目前用于防治疾病和作为饲料添加剂的主要是无机硒[1]。
有机硒与无机硒相比,具有较高的生物活性(比无机硒约高100倍)和较低的毒性[2],故人们越来越重视有机硒的补充。
硒酵母中有机硒含量较高[3],是一种比较理想的硒营养剂。
为了测定硒酵母中有机硒的含量,首先建立了一种无机硒和有机硒的鉴别方法,并且采用透析处理法使硒酵母中的无机硒和有机硒得以分离,再利用催化分光光度法,测定了硒酵母中有机硒的含量;为了确定硒酵母中有机硒的存在形式,采用氨基酸自动分析仪,测定了硒酵母中硒代胱氨酸(SeC y s)和硒代蛋氨酸(SeM et)的含量。
1实验部分1.1材料和仪器透析袋,SeM et(S3625),SeC y s(S3875)购自美国Si g ma公司。
分析仪器选用美国产的DU-7分光光度计和日立835-50氨基酸分析仪。
其他试剂均为分析纯级化学试剂。
1.2有机硒含量的测定1.2.1测定原理Se(Ô)能够催化氯酸钾氧化苯肼生成偶氮离子,继而与变色酸偶合成红色偶氮染料,生成的红色偶氮染料的吸光度与一定含量范围的硒成正比,因而可利用催化分光光度法测定Se(Ô)的量[4]。
采用透析处理使硒酵母中的无机硒和有机硒得以分离,并对透析内液进行消化测定,便可测得硒酵母中有机硒的含量。
收稿日期:1998-11-06;郝素娥,女,34岁,讲师(上接71页)Abstract A derivative gas chrom atographic m ethod for the determ ination of the content of dihydroxy2 acetone in its enz y me p roduction is described.D erivation conditions b y usin g trimeth y lchloro_silane,N, O_bis(trimeth y lsil y l)_acetamide,and m ixed a g ent of trimeth y lchloro_silane and hexam eth y l disilaz ane as derivative agent w ere discussed respectively.T he recovery and RSD of the method are98.3%~101.3% and2.02%~3.58%,respectively.Ke y words G as chromato g ra p h y,Dih y drox y acetone,Gl y cerine,Trim eth y l sil y lation第3期郝素娥等:硒酵母中有机硒及硒代氨基酸含量的测定方法73图1硒酵母的分析谱图Fig.1C hrom atog ram o f selenium y east1.S eC y s;2.SeM et表1硒酵母中有机硒、SeCy s 及S eM et 含量的测定结果Table 1D eterm inatio n results of organic selenium ,SeCy s andSeM et in seleniu m yeasts w /10-6Sam ple1#2#3#4#5#有机硒367.18478.92582.36699.16552.18S eC y s 569.34669.89858.28348.35698.28SeM et226.00261.02333.43318.40269.101.2.2透析方法将新鲜的硒酵母加入pH=8.6三羟甲基氨基甲烷-盐酸-甘油缓冲液中,加入SiO 2研磨,在电子显微镜下检查,待酵母细胞完全破碎后,装入事先处理好的透析袋内,扎紧上端,于蒸馏水中透析,其间不断换水,用无机硒和有机硒的定性鉴别方法,分别检测透析外液和透析内液,直到透析外液中检测不出硒时,停止透析。
1.2.3无机硒和有机硒的定性鉴别方法取含一定量硒(浓度大于50L mo l/L)的样品试液放入试管中,加入15%(w )的半胱氨酸溶液,摇匀后静置,加入1~2滴亚甲蓝溶液,并开始计时,对于有机硒,亚甲蓝的退色时间为5~10min;对于无机硒,亚甲蓝的退色时间为30~60s 。
根据退色时间即可定性鉴别无机硒和有机硒。
1.2.4消化方法准确称取一定量硒酵母样品于锥形瓶中,加入HNO 3-HClO 4混酸(体积比1B 4),加热至发烟,待溶液变为淡黄色后,再加热2~3min,此时溶液变为无色,冷却后,定容,即可进行测定。
1.2.5测定方法分别取含硒0.2m g /L 的亚硒酸标液0、1、2、3、4、5mL ,硒酵母样品3~6mL 于比色管中,然后依次加入0.02m ol #L-1ED TA 1mL,0.2mo l #L-1HCl-KCl 缓冲液2mL ,0.6mol #L-1氯酸钾2mL ,0.03m ol #L -1变色酸2mL ,0.03mo l #L-1盐酸苯肼l mL ,然后加水至刻度,摇匀,在沸水浴中加热20min,于冷水中冷却后,用l mL 比色皿于520nm 波长下测定吸光度。
1.3硒酵母中Se C y s 和Se M et 含量的测定1.3.1样品前处理准确称取硒酵母样品(0.5g 左右)于试管中,加入6mo l #L -1HCl 6mL,充氮气后封管,于50e 水解50h 。
1.3.2测定方法采用氨基酸自动分析仪测定硒酵母中SeMet和SeCy s 的含量,SeM et 的保留时间为(62.9?0.5)m in;SeCys 保留时间为(54.6?0.5)min 。
分析谱图见图1。
2结果与讨论2.1实验结果硒酵母中有机硒、SeCys 及SeMet 含量的测定结果见表1。
1#、2#、3#、4#、5#为作者制备的5种不同含硒量的硒酵母,硒酵母的制备过程中,培养基中亚硒酸钠的添加量分别为5、10、15、20、25m g /L 。
2.2硒酵母中有机硒含量测定方法的讨论如何测定生物样品中有机硒的含量,是目前亟待解决的一个问题。
本实验是利用透析的方法,使硒酵母细胞完全破碎后,选择一种比较合适的透析膜,只允许未被酵母同化的小分子无机硒通过,而与蛋白质或氨基酸结合的大分子有机硒不能通过。
在透析过程中不断换水,使内液中的无机硒不断通过透析膜转移到透析外液中,并利用半胱氨酸与无机硒和有机硒反应情况不同,而导致亚甲蓝退色时间不同来鉴别无机硒和有机硒,当透析外液检不出硒时,即已透析完全,此时透析内液中只能检测出有机硒了。
透析方法成功的关键是选择合适的透析袋,并利用新鲜酵母进行透析。
在利用催化分光光度法测定硒酵母中硒含量的过程中,消化方法和加热时间对测定结果影响较大,实验结果表明,用硝酸-高氯酸进行消化,加热20min 时,测定结果最接近于真实值,重复性也最好。
2.3硒酵母中Se M et 、SeC y s 含量测定方法的讨论采用普通的分析方法来分析包括SeMet 、SeC y s 在内的氨基酸混合物时,SeMet 的峰和SeC y s 的峰与其他氨基酸的峰相重叠,实验中采用了降低流速(1#泵的流速为0.275mL /min),长柱(4mm @250m m)的方法,使SeMet 、SeCys 与其他氨基酸的分离度达到了90%以上,比文献[5]报道的方法分离度显著提高,分析时间也缩短了7h。
74分析测试学报第18卷2.4硒酵母中有机硒的存在形式硒酵母作为一种有机硒补品,探明其有机硒的存在形式,对研究硒在生物体内的存在形式及其作用机制,对从分子水平阐明某些酶的催化作用以及许多疾病的发病机理等方面具有重要的理论意义;而对其在安全性、营养作用及合理服用等方面具有重要的实际意义。
经过实验确定,硒酵母中有机硒的主要存在形式是SeC y s(70%)和SeMet(20%),尚有10%左右有机硒是以其它形式存在,但由于其它有机硒的标准样品难以制备和买到,目前还无法确定其形式和含量。
硒酵母中有机硒及SeMet和SeCys含量的测定方法,对于其他生物制品中有机硒含量及含硒氨基酸含量的测定具有重要的参考价值;硒酵母中有机硒及SeMet和SeCy s的定量分析数据,对硒酵母今后在医药及添加剂领域的应用也具有重要的参考价值。
参考文献1徐辉碧.生物微量元素)))硒.武汉:华中工学院出版社,1983.15~202Schrauzer G N,W hite D A.Elem en tal seleniu m in o rganic selenium co m po und s:their chem istry an d bio lo gy.B io ino rg C hem,1983, 8(3):3033W estermark T.Selen ium and selenid es.Acta Pharm acal T ox ical,1987,4(1):1214顾钢,朱万珥,孙林林.利用新的催化显色反应测定人发中痕量硒.分析化学,1988,16(6):5595Peterso n P J,B utler G W.Pa p er chro m ato g ra p hic and electro p ho retic s y stem s for th e in ten tificatio n o f su l p hu r and selenium am ino acids.J C hrom ato g r,1962,8(1):70D eterm ination of Co ntent of Or g anic S elenium and S eleniumAm ino Acids in Selenium YeastsHao Su.e(D e p artment of A pp lied Chemistr y,Harbin Institute of Technolo gy,Haerbin15001)T en g Bin g(Analy sis Centre,Northeast A gricultural University,Haerbin150030)A bstract D etermination of content of organic selenium,selenocystine(SeCys)and selenom ethionine (SeM et)in cultured selenium y easts is re p orted.T he inor g anic selenium and or g anic selenium w ere se p erated w ith dial y sis ba g,and the content of or g anic selenium in selenium y easts w as determined b y catalytic spectrophotometry;the content of selenocystine and selenomethionine in selenium yeasts w ere determined b y amino acid anal y z er.K e y words Selenium y east,O r g anic selenium,S elenoc y stine,Selenom ethionine[书讯]5现代化学试剂手册6第6分册由周良模、商振华、万邦和等教授编写的5现代化学试剂手册6第6分册/仪器分析试剂0(精装本)已于1998年1月由化学工业出版社发行,全书共分气相色谱、高效液相色谱、平面色谱、光谱、波谱、电化学及衍生化试剂等9章,近143万字,900页,汇集约1300种试剂,分别介绍了它们的名称、结构、物化性能、制备方法及应用等,是从事仪器分析、试剂研制、开发人员必备的工具书。