呈色反应注意要点：
① 底物浓度： 应够高，保证最大反应速度; ② pH值： 满足酶活性的最适pH，常由缓冲液提供; ③ 温度： 室温即18℃-22℃，或37℃； ④ 时间： 显色反应时间应在镜下观察来控制，
以特异性显色清晰而背景又无非特异性着色时即可 终止反应。
（二）染色程序
1 直接法（冰冻切片）
1）新鲜组织切片,冷丙酮固定10min,干燥后,入PBS。
2）0.3％H2O2 -甲醇液处理30’,封闭内源性过氧化物酶; 3）0.0l mol／LPBS洗3次。
4) 5％-10％正常羊血清室温处理30min。
5) 1:50-1:100 HRP-标记抗体, 37℃孵育60’或4℃过夜。 6) 0.0l mol／L PBS洗3次。 7) DAB／H2O2显色(新鲜配制)。 8) 0.01mol／LPBS洗3次。 9) 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。
酶标抗体法-间接法
原理：将酶标记在二抗上，先将 一抗与相应的抗原结合，形成抗 原抗体复合物，再用二抗(酶标抗 体)与复合物中的特异抗体结合， 形成抗原-抗体-酶标抗体复合物， 最后用底物显色剂显色。 优点：只需一种酶标抗体即可 。 缺点：敏感性低，但优于直接法。 依靠化学连接对酶及抗体活性有 影响。
2 间接法
1) 石蜡切片脱蜡至水；
冰冻切片
3) PBS漂洗
室温干燥--丙酮固定----缓冲液漂洗溶去OCT包埋剂
2) 甲醇双氧水室温处理切片15～30min,封闭内源性过氧化物酶活性。
4) 0.1％～1％牛血清白蛋白(BSA),湿盒内室温孵育15～25’,然后吸去孵育 液,不冲洗.
5%～10％正常兔血清(或山羊血清),湿盒内室温孵育15～20’然后吸去。
酶标抗体法-直接法
原理：将酶直接标记在一抗上， 然后直接与相应抗原特异地结合。 形成抗原-抗体-酶复合物，最后 用底物显色剂显色。
优点：简便、快速、特异性强， 非特异性背景反应低。 缺点：浪费抗体、敏感性极低。 依靠化学连接（共价键）对酶及 抗体活性有影响。 每种抗原必须分别用其抗体的酶 标记物。
3 GOD(葡萄糖氧化酶)：
以β-D-葡萄糖底物，被GOD氧化生成的H2O2，又作为
HRP的催化底物，最后仍可用DAB显色。 适用于两种酶的放大技术： 即用GOD和HRP分别标记第二和第三抗体(如第一抗体是 小鼠mAb，第二抗体为GOD标记的兔抗小鼠IgG，第三抗
体为HRP标记的羊抗兔IgG)，孵育液即含有葡萄糖，又 含有DAB，此法可提高免疫染色的敏感性和特异性。
5)滴加PBS适当稀释的第一抗体,湿盒内孵育,或4℃过夜,或室温2～4h。
6) PBS充分冲洗 7) 滴加适当稀释的酶标第二抗体,湿盒孵育45～60’(室温或37℃)。 8) PBS漂洗(3次,每次2-5’)。
9)显色： ① HRP标记抗体（0.01-0.1% H2O2 + 0.01-0.5％DAB液） ② ALP标记抗体 （2mg磷酸萘酚AS-MX+0.2ml二甲基甲酰胺，用前加坚牢红TR盐)。 切片入此液,室温10～15’。 ③ GOD标记抗体 （β-D-葡萄糖67mg + 硝基蓝四唑6.7mg+吩嗪甲硫酸酯0.107mg， 37℃孵育1h。 10) 流水中终止呈色反应； 11) 复染细胞核（甲绿、苏木精）；10s 12) DAB显色标本-----树胶封固。 其它------------水溶性介质(如甘油明胶)封固。 13) 镜检结果：按上法HRP阳性者呈棕色，ALP法阳性者呈红 色，GOD法阳性者呈蓝色。
一、酶标抗体免疫组织化学染色法
（一）原理 直接法和间接法。
直接法--是将酶标记在第一抗体上,直接检测细胞内特异性抗原。 间接法---两步法 一抗：是细胞组织内抗原的特异性抗体； 二抗：是抗一抗的抗体,并且已用酶标记。 (注意:第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的,因 为第二抗体往往是用第一种动物的IgG所制备。)
第三章 免疫酶组织化学技术
免疫酶组织化学技术
酶------辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶…… 酶标记已知Ab(或Ag) + 组织细胞内相应的Ag(或Ab)
抗原抗体复合物(酶标) 底物
有色沉淀 定位； 图像分析仪半定量
免疫组化方法

酶标抗体免疫组织化学 直接法 间接法

非酶标抗体免疫组织化学
酶桥法 PAP法、APAAP法
免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记
的抗原抗体复合物，再依据酶与底物作用生成不溶 性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位，并借此确 定该抗原的性质、存在的部位和含量。

显色反应 :

酶 + 底物====不溶性的色素
标记酶: 辣根过氧化物酶 (HRP) 碱性磷酸酶(ALP) 葡萄糖氧化酶(GOD) β-D-半乳糖苷酶……
2

碱性磷酸酶
ALP：


显色：产物蓝色或红色。 以磷酸萘酚AS-MX为底物，被ALP水解后生成萘酚 AS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等 偶联生成不溶性染料(坚牢蓝或坚牢红)而成。 优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被 抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高 特异性。 缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明 确。
1 辣根过氧化物酶 HRP：
2

碱性磷酸酶
Байду номын сангаас
ALP：


显色：产物蓝色或红色。 以磷酸萘酚AS-MX为底物，被ALP水解后生成萘酚 AS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等 偶联生成不溶性染料(坚牢蓝或坚牢红)而成。 优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被 抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高 特异性。 缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明 确。
1 辣根过氧化物酶 HRP：
显色：产物棕褐色 HRP与底物过氧化氢和DAB作用产物棕褐色，有嗜锇性。 DAB性质： 电子供体，较敏感，室温时较稳定，显色后切片可长期 保存。可致癌，可将DAB制成10倍浓度储存液，分装后-20℃ 贮存。 注意事项：孵育时间和配置方式易产生背景着色 浓缩的DAB—按照说明书；注意校正蒸馏水的PH值； 粉剂DAB----溶解时滤去不溶性颗粒； 现用现配---保存时可产生氧化物沉积在切片上，形成斑点。 临用前加H2O2