➢ 另外，由于荧光染料的使用，使得2D-DIGE具 有高灵敏度的特性，能够满足高通量定量蛋白 质组学研究分析的要求。
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荧光扫描仪
细胞工程教Leabharlann 室细胞工程教研室三 同位素标记技术
♫ 原理
多肽和蛋白质的质谱响应值受许多难以控制的 因素的影响，特别是其离子化效率受其他物质 和条件的影响很大，具有很强的体系依赖性， 因而不能对来自相同肽段两次质谱检测得到的 信号强度像色谱定量中那样进行比较定量。
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✓ 细胞培养条件下稳定同位素标签技术 （SILAC） 通过细胞的正常代谢，把稳定同位素标 记的氨基酸引入到蛋白质组成中，大大 简化质谱定量分析前人工处理的复杂度。 可用在细胞培养条件下的稳定同位素有： 2H、13C和15N等。
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۩ 酶解过程引入标记
➢ 18O/16O水
➢ 2-DE-MS技术体系
• 无标记的蛋白质双向电泳 • 荧光差异凝胶电泳 • 基于同位素标签和自动化的串联质谱
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☻定量分析方法
✓ 定性差异分析和定量差异分析 ✓ 绝对定量和相对定量 ✓ 凝胶差异分析和非凝胶差异分析 ✓ 标记定量法和无标记定量法
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二 荧光染料分析法
♣ 双向电泳（2-DE）凝胶染料显示 ✓ 考马斯亮蓝 ✓ 银染 ✓ 荧光染色 ✓ 荧光标记
第九章 定量蛋白质组学研究技术
石晓卫 E-mail：xwshi205@
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定量蛋白质组学
• 定量蛋白质组学是指把一个基因组 表达的全部蛋白质或一个复杂的混 合体系中的目标蛋白质进行精确定 量和鉴定。
• 这一概念的提出标志着蛋白质组技 术的不断改进和完善。蛋白质组学 研究已从对蛋白质简单的定性向精 确的定量方向发展。
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♣ 荧光双向差异凝胶电泳（2D-DIGE）
➢ 目前，在传统2-DE技术的基础上发展出的2DDIGE，采用专有的荧光染料（Cy2、Cy3、Cy5） 与多重样本和图象分析的方法，在同一块胶上 可同时分离多个由不同荧光标记的样品，并以 荧光标记的样品混合物为内标，对每个蛋白质 点和每个差异都可以进行统计学可信度分析， 从而具有良好的重复性和较高的准确率。
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一个肽的惟一适合的内标准是标记有稳定同位 素的同一个肽。所以，在完整蛋白或消化后的 多 肽 中 引 进 稳 定 同 位 素 （ 如 2H 、 13C 、 15N 、 18O）标记的小分子，用来识别不同样品来源 的肽段，经“轻”质和“重”质同位素标记的 不同多肽互相作为内标，化学性质基本上是一 样的，这样就可以确保同一次质谱扫描中两者 的离子化效果是相同的，此时肽质谱峰信号成 对出现，质谱峰的信号强度就可以作为定量的 依据。它们的相对强度就精确地反映了原样品 中多肽的比例（也就是蛋白的比例）。
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♫ 分类
➢ 同位素标签引入方法
• 生物代谢方式 • 化学方式 • 酶解过程引入
➢ 同位素标记引入法
• 体内标记【代谢标记法（SILAC）】 • 体外标记【化学标记法（ICAT）】
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۩ 生物代谢方式引入标记
➢ 原理
将一定量的相同种类但表达水平不同的 两个（细胞）样品分别置于正常培养介 质和富含某重质同位素（如：15N）的相 同介质中培养，一定时间后将两者混合 酶解，然后选择性亲和分离、色谱分离， 并进行质谱分析。
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主要内容
※ 定量技术体系与分类 ※ 荧光染料分析法 ※ 同位素标记技术 ※ 针对性亲和标签技术 ※ 同位素标记技术的应用
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一 定量技术体系和分类
☻ 技术体系
✓ 双向电泳-质谱技术体系 ✓ 蛋白质芯片分析体系 ✓ 基于同位素标记的质谱分析技术体系
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ICAT试剂组成： 反应基团（特异 性结合肽链中半 胱氨酸残基的巯 基） 连接子（结合稳 定同位素） 亲和标签—生物 素（可与卵白素 结合，选择性分 离标记的多肽）
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➢ 操作流程
同位素标记亲和 标签轻试剂标记 的细胞蛋白质1
同位素标记亲和 标签重试剂标记 的细胞蛋白质2
混合， 胰酶水解
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۩亲和标签法引入标记
➢ 原理
同位素标记亲和标签技术（ICAT）由Gygi等 于1999年发明。此技术是利用同位素亲和标签 试剂，预先选择性地标记某一类蛋白质，分离 纯化之后进行MS鉴定。根据MS图上不同同位 素标记亲和标签试剂标记的一对肽段离子的强 度比值定量分析样品的相对丰度。
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阳离子交换
卵白素 亲和层析
LC分离，MS分析， 数据库检索
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➢ 优点
✓ 兼容任何生长条件下的组织中的蛋白质样品； ✓ 烷基化反应高度特异； ✓ 只分离含有半胱氨酸残基的肽段，降低了体
系的复杂性； ✓ 可对膜蛋白进行鉴定和定量； ✓ 建立在色谱技术的基础上，任何促进蛋白质
在两个要比较的蛋白质样品的酶解过程中分别 加入18O和16O水，这样可特异性地对酶解肽段的 C末端进行标记，等量混合后进行质谱分析样 品间蛋白质组的差异。混合样品须快速鉴定。
➢ 酶解标记H218O
在H218O的溶液中进行蛋白质酶解，可在其C端 稳定结合1或2个18O原子。
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➢ 整体内标技术（GIST）
通 过 用 N-acetoxy-[2H3]-succinimide/ N-acetoxy-succinimide(NAS) 乙 酰 化 处 理酶解肽段，把同位素标签引入样本分 析体系中。NAS可标记必需氨基酸亲和 肽段的N末端。由于肽段的乙酰化位点 不一，被标记的重链和轻链质量差也不 固定，给自动化分析带来了一定困难。
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➢ 方法
✓ 15N/14N蛋白质标记技术 分别用富含15N/14N的细胞培养基培养要 比较的细胞或者简单生物体，通过生物 代 谢 的 方 式 以 15N 替 代 氨 基 酸 组 成 中 的 14N ， 进 而 把 15N 标 记 引 入 蛋 白 质 组 成 中 。 由于氨基酸组成的不固定（从甘氨酸的 1个到精氨酸的4个），因此还没有把此 标记用在细胞培养上的报道。