WOIRD格式微生物限度检测方法学验证方案&D.|[0w#j!Q+{/w7^#E:k'p(t9J!T3W#O&W!d8S*\7k!y$k!C1A|*Q4X*I)[5@8g%_8H0}!X:c5V4s:w%J'K)}0Q-W:H1f9N$[4V7L7}文件编号：P-AMV002-1101"r%|2C7e-IY#s%f1v8U8D4M(n(q*a6o3e2f0z/_9`'j5[+y9c&C)D!O*O\%X:d,r0C(o3D"A2c,\6C'j+^(L1L-n3{/J;K执行前批准签字页2N+}8E8x%C!M1b2~1o'}方案起草姓名公司/岗位签字日期:c"s'R:u"l1q#l'o)}8h (@.}&N#s;[2E)H&U!R1G5Q-h5N)|+I2p方案审核姓名公司/岗位签字日期+N:w0{4j"`"}-x4r(Z#P;a3Z/|0U1\2P&v6j*`2h方案批准姓名公司/岗位签字日期$p1h:X#G"u.})B;d.V7R!@7t5v&D9a0l!i,W4p4o6f+Z4V7s*X3F8A7B3q"`1g6T9y;U,k+k9b目录,t,n2w&_4mT1.目的42.范围4,V*l"_%Q5f,K#k3.责任者及职责43^X*Q$x(E3g:B)E4.验证简介45．验证过程76．结果判断76c9[/O1U&R7．结论和建议7%{)x.{$f%I8．异常情况报告7*E.Q.`;?!k#q9．再验证710．附件8/O0@.@8O!`:c5c1n!k1L)N.^2w+d3Y%V1.目的$M;j2K6p'|:y3F'K+K按照中国药典2010版（第一部），采用平皿法对龙加通络胶囊（成品）进行微生物限度检查，本方案是对此方法进行验证。
;x'?8a'^6C5@!^2.范围&J+b'o7r7m6Z5t龙加通络胶囊成品8A,S/U]3h1J3.责任者及职责部门职责QC起草并审核验证方案进行验证试验的具体操作完成验证记录中相关操作记录的填写根据验证结果起草和审核验证报告6q5D5e1|(h,f3CQA审核并批准验证方案和验证报告(S&h:^!z#k,K:B1Q!j)?&^监督验证方案的实施7?4y(`6P(r4.验证简介4.1定义CFU：菌落数供试液3].N/E/p"O8}6C7R4d取样品10g，取pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液稀释至1g/ml（1:10）。
供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
'S#h$n1U:X's/J)e"C 试验组取规定量供试液采用平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。
菌液组测定所加的试验菌数。
%I8Y$G*Q4f;u.C*|%l+N样品组样品溶液菌悬液（50-100CFU）稀释液平均菌落数(CFU/皿)供试液对照组+-+C供试液对照组3G#_,O-A'P#P;H试验组+++C试验组菌液组-+-C菌液组'z5n%U:j2A(~"}N4.2菌悬液4.2.1菌种及来源(y)W#A2Q$p.I8y4M4m"z.|#p本次验证涉及到金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，其详细情况如下：培养基名称名称及代号编号批号代次有效期至来源营养琼脂;{#X!e5G$K.I培养基金黄色葡萄球菌5A"m%R/H!`4[+s3@CMCC(B)26003注释1注释2中国生物制品检定所"x7i8@#~+k1j"L2c大肠埃希氏杆菌!C+G)S,c-NH+pCMCC(B)44102"`;X#m%_8R,`枯草芽胞杆菌5s,C2Q%{Sy.{#QCMCC(B)63501;A1n#H6t"?.X&O6{3J玫瑰红钠5\$K6K+D9["~3G)g$a#s)t1r7O琼脂培养基白色念珠菌6|!x+?&N*Rs9i;k%aCMCC(F)98001,G]:s"h0A!p(D黑曲霉CMCC(F)98003+Rf(L/N:h5[+A8|2J备注$D'_2t'\#O检查人：复核人：检查日期：4.2.2菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30~35℃培养18~24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，20~25℃培养24~48h。
上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100CFU的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100CFU的孢子溶液。
4.3培养基及稀释液4V)Z!~!g%z%U0l4.3.1培养基和稀释液的名称:U*_*Z6d5M9x0z:E6f培养基：营养琼脂培养基（121℃15分钟）、玫瑰红钠琼脂培养基（121℃15分钟）稀释液：pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液（121℃30分钟）4.3.2培养基灵敏度复核!V&g5[D)u;W${9B培养基灵敏度复核，参见《培养基的灵敏度检查操作规程》，结果见附件1。
-J7d9o+a)D9YC8 C4.4供试液的制备4.4.1样品名称及数量9v:m&Z7S.F&P$B.}*?(X+e:k)|-j:[样品名称批号取样量#e6u&X*|+M$a"n龙加通络胶囊（成品）10g0o9m;o'^/a1v'q10g"R'S!H.Q6y.{6_1q10g4.4.2样品预处理方法取样品10g，取pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液稀释至1g/ml（1:10）。
'k8i3^4Y9e&t.^4.5实验用品2i4r(D"\+t-@实验设备名称型号规格厂家有效期t0a,y:`/z$r;E(X低温培养箱注释3(y(O*J!{9S6r'S.y9h生化培养箱注释3)b5m4p#O7T8X洁净工作台——+m"Y#b3N#v"B-C0u6?生物安全柜——,P.@+B#x!l4_"h#h*Z7h水浴锅——0g7z/~8m.d-c备注检查人：复核人：检查日期：(Y,b;E.`8|实验中使用培养基2y0O,F3B5e$p名称规格厂家8g$t#a0k:z(q5U8I营养琼脂培养基,o)@8`$h'n1X%O玫瑰红钠琼脂培养基8Q;h7z+f7D硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基营养肉汤培养基改良马丁琼脂培养基4.6参考文件1}"f$Z+uz.]+f中国药典2010版第一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法《验证管理规程》8Z)P!l;L!a+{《超标数据调查及处理管理规程》《异常情况管理规程》#W)\"V:r$m)k)D《取样管理规程》《培养基管理规程》"C9\4B6[/_.t-q-t1h《培养基的灵敏度检查操作规程》*K6X)H*f'm#R&T.Q5X4[/sb!w《菌种复苏、传代及菌悬液制备操作规程》8[7m#I9_9h5[《微生物限度检查操作规程》5．验证过程5.1试验次数：验证试验应进行3次独立平行实验4k$R,F!n0c5_&S1~(c5.2试验器具准备0p"t$o9~0V0b+T8k试验前，将先前已准备的适量稀释液和培养基灵敏度复核检查合格的培养基、检品和无菌的玻璃平皿（Φ90mm）一同放入无菌室的传递厨内，打开送风和灭菌按钮。
;e4O1j1x*Z0x用当月使用的消毒剂对无菌室进行消毒，并擦拭超净台，打开超净工作台风机及紫外灯灭菌1小时以上。
5T'L"l0c8m@5.3测定4M:~1x$m!J1a7@,S:|*k'B5.3.1按照无菌室更衣程序更衣，进入无菌室。
-^:Y"p2\5t1v%W8K5.3.2用70%酒精棉球擦拭工作台面与待测品表面。
5.3.3在无菌环境下，取4.2.2项下配制的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml，分别注入无菌平皿中，立即将保温在水浴锅中（45℃）无菌营养琼脂培养基倾倒入内，每个平皿约20ml，每株试验菌平行制备2个平皿。
待培养基混匀、凝固后准备培养计数；取4.2.2项下配制的白色念珠菌、黑曲霉各1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注保温在水浴锅中（45℃）无菌玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，待培养基混匀、凝固后准备培养计数；以上作为菌液组。
5.3.4无菌操作取4.4.2制备的预处理后的样品，加入至4个无菌平皿中，每个加入1.0ml。
将保温在水浴锅中（45℃）无菌营养琼脂培养基和无菌玫瑰红钠琼脂培养基培养基分别倒入2个无菌平皿中，每个约20ml。
作为供试液对照组。
5.3.5无菌操作取4.4.2制备的预处理后样品，加入至10个无菌平皿中，每个加入1.0ml，同时将4.2.2项下配制的5种菌液每种加入到2个已加入样品的平皿中，每个平皿加入1.0ml。
将保温在水浴锅中（45℃）无菌营养琼脂培养基和无菌玫瑰红钠琼脂培养基培养基按4.2.1项下规定，加入到平皿中，每个约20ml。
作为对照组。
5.3.9将5.3.3-5.3.5制得的平皿按下表进行培养，结果记录在附件2上。
培养基培养温度培养时间菌种名称营养琼脂培养基30-35℃3天金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌玫瑰红钠琼脂培养基23-28℃5天白色念珠菌、黑曲霉"W*?+h5i6E6．结果判断;`+Z1P$`"b2Z:O在三次独立的平行试验中，试验组的菌落数回收率K(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%。
若三次独立试验中任何一次K低于70%，应改进试验方法以消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
+l/ |(M.Z-c&U/W试验组的菌落数回收率K=×100%7．结论和建议此项中将根据实际测试的结果给出结论，有异议的将给出建议。
8．异常情况报告对验证中发现的任何异常/不合格情况应按照《异常情况管理规程》执行。