自来水大肠菌群的检测
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（南京工业大学生物与制药工程学院 南京 211800）

【摘要】水是制药和食品行业使用最为广泛的原料，也是赖以生存和发展的物质基础。水与
药品、食品中的其他原料一样，必须符合既定的质量标准，如果水被污染就会影响多批次
产品。另外，对微生物实验室来说，水是各种培养基、缓冲液、检测剂的主要组成部分实验
采用自来水作为样品，对样品进行接种，分离，纯化，培养得到具有不同特征的肠杆菌。通
过对肠杆菌的数量和形态特征的分析，确定自来水是否被污染和污染程度。

【关键词】多管发酵，大肠杆菌，最大可能数(MPN)，发酵实验，革兰染色
前言：城市生活供水水质与人们生活息息相关，为确保饮水合用水安全，必须对其进行严
格的常规监测。但是水体中直接检测出病原微生物比较困难，因为它们数量极少，而且培
养条件苛刻，分离鉴定比较困难。因此常选用指示微生物作为水体中病原微生物数量的指
标。大肠菌在人体内和粪便中存在很多，受气污染的水体中较容易检测到大肠菌的存在，
并且检测方法简单。因此，常用大肠菌群为指标评价水的卫生质量。
大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24-48h能发酵乳糖产酸产气的革兰阴性无芽
孢杆菌，包括埃希菌属（Escherichia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属
（Enterbactor）、克雷伯菌属（Klebsiella）。大肠菌群数是指每升水之中含有的大肠菌
群的近似值，根据水中大肠杆菌数的数目即可判断水源是否被污染，并推断水源受肠道病原
菌污染的可能性。本实验采用多管发酵法对水质微生物进行分析。该方法适用于各种水样，
包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三部分。初发酵试验室用无菌操作技术向一系列装
有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中接种一定量水样，培养。能产酸产气者说明水样中含有大肠
杆菌群细菌。再根据产酸产气（阳性）管数求出100ml待测水样中是否存在大肠杆菌群细菌，
而且可以检测出待测水样中大肠杆菌群的最大可能数。平板分离试验是对于发酵乳糖产酸产
气的阳性管用接种环以无菌操作技术取一环其中的培养物，在伊红美蓝平板做划线接种，培
养。若菌落呈深紫红色，为典型的大肠菌落菌群；菌落为粉红色、粘液状、不透明，为非典
型的大肠菌群菌落；否则其他特征菌落均为非大肠菌群菌落。因此，通过平板分离试验可进
一步确认水样中大肠菌群细菌的存在。复发酵试验是取典型或非典型的菌落，进行革兰氏染
色并镜检，若为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则再将其接种于乳糖蛋白胨培养基中，培养。如果
产酸产气则证实存在大肠菌群细菌。

1、 材料与方法
1.1材料
1
.1.1实验仪器：超净工作台、恒温培养箱、显微镜等。

1.1.2 培养基：乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨2.0g、乳糖1.0g、牛肉膏0.6g、氯化钠1.0g、
1.6%溴甲酚紫溶液0.2ml、蒸馏水200ml、PH7.4。（分装于试管中，内含倒置杜氏小管）
3倍浓度乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨0.75g、乳糖0.375g、牛肉膏0.225g、氯化钠0.375g、
1.6%溴甲酚紫溶液0.075ml、蒸馏水25ml、PH7.4。（分装于试管中，内含倒置杜氏小管）
伊红—美蓝（EMB）培养基：伊红—美蓝（EMB）培养基粉末9.0g、200ml蒸馏水、pH7.2。
1.1.3 染色剂：草酸铵结晶紫染色液、路哥碘液、番红染色液。
1.1.4 水样：隔夜的自来水水样。
1.1.5 其他：取样器、灭菌移液管、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、
擦镜纸等。

1
.2实验方法

1.2.1 初发酵实验：
（1）对15支试管进行标号；
取五支装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养基试管，标记水样名称和加水量10ml；（编号1—5）
取五支装有乳糖蛋白胨培养基试管，标记水样名称和加水量1ml；（编号6—10）
取五只装有乳糖蛋白胨培养基试管，标记水样名称和加水量0.1ml；（编号11—15）
（2）接种：
用移液枪分别取10ml水样加入1—5号试管中；分别取1ml水样加入6—10号试管中；分
别取0.1ml水样加入11—15号试管中，摇晃均匀。
（3）培养：
将以上接种后的所有试管放入37℃培养箱中培养48h。
（4）观察实验结果：
培养48h后观察记录各加水量产酸产气的管数，即阳性试管。然后根据大肠菌群存在
的管数查大肠菌群数得出每100ml水样中大肠菌群MPN，报告每升水样中大肠菌群数。利用
Thomas公式计算最大可能数。
MPN/100ml=阳性管数X100/√(阴性管中的水样体积X全部试管中的水样体积)
1.2.2 平板分离：
（1）将试验中产酸产气试管中培养物以无菌操作技术分别在EMB平板上进行划线接种（要
求长出单菌落），于37℃培养24h。
（2）培养24h后观察菌落特征。菌落特征类型有：
①菌落深紫色，有金属光泽——典型大肠杆菌群菌落；
②菌落深紫色，无金属光泽——典型大肠杆菌群菌落；
③菌落粉红色、粘液状、不透明——非典型大肠杆菌群菌落；
④其他特征。
（3）挑取呈①②③菌落特征的菌进行革兰染色、镜检，观察革兰染色反应结果和观
察芽孢有无。
1.2.3 复发酵试验：
（1）用接种环分别挑取经确认为革兰阴性、无芽孢杆菌的菌落上的菌种接种于乳糖
蛋白胨培养基上（编号1—7），于37℃培养24h。
（2）培养24h后，观察产酸产气情况。凡是产酸产气者，即可最终确认为大肠杆菌群
细菌。
（3）根据复发酵实验结果，再计算100ml水样中大肠杆菌MPN。

2、 结果与分析：
2.1 初发酵结果：
15支试管全都产酸，但其中两支试管内的杜氏小管内无气泡，实验数据如下，阳性组合
为5-5-3，查阅大肠菌群检数表可得每100ml水样中细菌MPN为920。
表1：初发酵实验结果
管数 水样/ml 阳性 阴性
5 10 5 0
5 1 5 0
5 0.1 3 2

2.2 平板分离结果
阳性管培养物划线接种培养24 小时后，EMB 培养基中长出深紫色有金属光泽的单菌落，
菌落较小，呈圆形，表面和边缘光滑，是典型大肠菌群菌落

2.3镜检结果
从EMB培养基中挑取上述特征的菌进行革兰氏染色，观察得菌体呈粉红色，为革兰氏阴
性菌，镜检照片如下：
2.4 复发酵结果：
经过24h培养后，两支试管皆产酸产气，可认定为大肠菌群细菌。

3.结果与讨论
经过一系列的实验表明，该水样中存在大肠菌群。并且，大肠菌群存在的数量已经超出生活
饮用水的卫生标准规定，但是由于该水样是过夜的水样，因而，实验数据不具有准确性，但
是过夜的自来水样大肠菌群数严重超标，不宜饮用。

心得体会： 这次实验验证了自来水中存在大肠菌群及其数量标准。通过对整个实验的把握、
计划及实验步骤的实施，可以看出，在实验当中我们还是缺少对整体实验的细致了解和计划。
对实验可能出现的结果不能提前预测分析，缺少对问题的深入理解。这次实验同时也体现了
许多我们操作上的不规范，不能完全按照无菌接种计术来完成实验，导致误差变大，和轻微
污染。
参考文献：[1]袁丽红、陆利霞、李霜，微生物实验[M]，化学工业出版社，2006.
[2]国家环境保护总局编，中华人民共和国环境保护行业试行标准[S]，中国环境
科学出版社，2007.
[3]高瑞坤，汤琳等.水中粪大肠菌群快速检测方法—固定底物酶法与多管发酵的
比较.[J]中国环境检测.2008.24(4).40~41