显色或荧光底物的高通量筛选
大部分荧光和显色底物都带高酸度的苯酚或苯胺 离去基团，当前广泛应用的是以硝基苯和伞形酮 衍生物作为底物的检测方法。 基于这种技术的检测方法简单快捷，结果准确容 易实现数字化，可以做到实时监控，得到了广泛 的应用。 但这类底物通常不够稳定，反应特异性差，反应 速度快，比普通底物高出几个数量级，不适用于 一些难转化的和难合成的反应以及粗酶催化的反 应和一些条件剧烈的反应，如高温，高的pH值等。
随机插入/去除技术 半理性外显子重组技术 合成重组技术 计算机辅助设计技术
酶分子的定向进化（小结）
定向进化不仅是一个酶分子改造的良好工具，也是探索和 研究酶蛋白构效关系的良好工具。 随着各种基因技术的应用和发展，究方向是更有效的突变技术和构建更简洁的突 变体库的技术。 突变体的筛选技术仍然是主要技术瓶颈，当前除了要继续 发展本文介绍的各种结合酶催化功能的高通量筛选技术， 还要进一步完善各种与重组表达技术相结合的蛋白筛选技 术和蛋白展示库技术。尤其是一些无明显表型的突变体的 筛选还需给与更多的研究与重视 。
酶分子的定向进化
定向进化是一个由构建突 变体库，突变体表达，表 达后筛选三个步骤组成的 循环递进过程，需要： (1) 产生包含大量带有微 量有利突变的突变体的文 库; (2) 突变体应能在适当的 微生物(如大肠杆菌或酵母 菌) 体内进行功能的表达; (3) 必须有一种灵敏的筛 选方法,能反映出由一个氨 基酸的置换而F, Tiss A, Rivière C, Verger R: Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur J Lipid Technol 2000, 133-153. A comprehensive and detailed review about all lipase assays involving carboxylic ester hydrolysis 11Beisson F, Ferté N, Nari J, Noat G, Arondel V, Verger R: Use of naturally fluorescent triacylglycerols from Parinari glaberrimum to detect low lipase activities from Arabidopsis thaliana seedlings. J Lipids Res 1999, 40:2313-2321. 12Klein G, Reymond J-L: Enantioselective fluorogenic assay of acetate hydrolysis for detecting lipase catalytic antibodies. Helv Chim Acta 1999, 82:400-407. 13Pérez Carlón R, Jourdain N, Reymond J-L: Fluorogenic polypropionate fragments for detecting stereoselective aldolases. Chem Eur J 2000, 6:41544162. 14List B, Barbas CF III, Lerner RA: Aldol sensors for the rapid generation of tunable fluorescence by antibody catalysis. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:15351-15355. 15Copeland GT, Miller SJ: A chemosensor-based approach to catalyst discovery in solution and on solid support. J Am Chem Soc 1999, 121:43064307. 16. Morís-Varas F, Shah A, Aikens J, Nadkarni NP, Rozzell JD, Demirjian DC: Visualization of enzyme-catalyzed reactions using pH indicators: rapid screening of hydrolase libraries and estimation of the enantioselectivity. Bioorg Med Chem 1999,7:2183-2188. 17. Janes LE, Löwendahl AC, Kazlauskas RJ: Quantitative screening of hydrolase libraries using pH indicators: identifying active and enantioselective hydrolases. Chem Eur J 1998, 4:2325-2331. 18 Bornscheuer UT: Methods to increase enantioselectivity of lipases and esterases. Curr Opin Biotechnol 2002,13:543-547. 19Jenne A, Gmelin W, Raffler N, Famulok M: Real-time characterization of ribozymes by fluorescence resonance energy transfer (FRET). Angew Chem Int Ed Engl 1999, 38:1300-1303. 20Jandeleit B, Schaefer DJ, Powers TS, Turner HW, Weinberg WH (1999) Combinatorial materials science and catalysis. Angew Chem Int Ed 38:2494–2532 21Reetz MT, Becker MH, Liebl M, Fürstner A (2000a) IR-thermographic screening of thermoneutral or endothermic transformations: the ring-closing olefin metathesis reaction. Angew Chem Int Ed 39:1236–1239 22Holzwarth A, Schmidt H-W, Maier WF (1998) Detection of catalytic activity in combinatorial libraries of heterogeneous catalysts by IR thermography. Angew Chem Int Ed 37:2644–2647 23Hirose A, Esaka Y, Ohta M, Haraguchi H: On-line HPLC determination of enzymatic activity of alkaline phosphatase in natural water using spectrofluorometric detection. Chem Lett 1993:307-310.
酶的高通量筛选与定向进化
高通量筛选技术 目的基因 基因突变技选技术 有益正向突变 高效生物催化剂
生物催化剂 定向进化
展望
高效的筛选技术使我们可以筛选到更多的新酶， 定向进化技术使酶的性质得到了极大的改善使酶 更加适合工业应用，这些技术的发展和完善使生 物催化的应用成为可能，并继续推动着生物催化 向各个领域不断渗透。 人们对经济的生产方式的追求，对能源与环境的 重视，尤其是对医药和精细化工产品日益增长的 巨大需求，进一步推动了生物催化在各个领域的 广泛应用和飞速发展。
酶的高通量筛选与定向筛选
报告人：黄剑宇 导 师: 张 卫
生物催化简介
生物催化与转化是以细胞或酶作为催化剂进行物质转 化，大规模生产化学品、医药、能源、材料的科学。
优点：一个生物催化剂可以催化一系列底物甚至很多非天然底物；酶 优点 具有高度的选择性尤其在立体和区域选择方面具有化学催化剂无法比 拟的优越性；生物催化反应通常反应条件温和具有环境友好性。 缺点：生物催化剂在目的介质中的不稳定性导致的活性降低甚至完全 缺点 丢失；虽然生物催化剂可以催化我们所知的各种反应，但对于特定的 底物和产物可选择的酶通常是很少的，而且目前只有极少数的酶可以 商业获得；从酶的发现到生产应用通常是一个艰苦的漫长的过程。 实际应用取决于它与传统工业过程的竞争，只有在竞争获得明显的经 济优势才能得到生产应用
酶分子的定向进化
通过以上方法从自然界筛选到的酶通常还 无法适应工业应用的需求，主要限制因素 包括 酶对非天然底物的惰性， 在工业应用环境中的不稳定性和低的耐受 力， 在非水环境下的低活力， 对辅酶的依赖等。
酶分子的定向进化
定点突变等基因改造技术， 改变蛋白序列中的个 别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进 行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工 程技术又称为分子进化的理性设计。 采用随机的基因突变或基因重组技术结合定向的 突变体筛选方法的分子进化技术称为定向进化。 这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这 一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特异性、 立体选择性等酶的催化特性和酶的催化能力的改 进和新兴的代谢途径工程。
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
pH指示剂显色高通量筛选
许多水解反应伴随pH的变化，根据反应介质和反 应平衡常数选择合适的pH指示剂可以准确的检测 水解反应速率。pH指示剂显色技术被广泛地用于 腈水解酶和酯水解酶等水解酶的筛选 Quick E法通过pH指示剂的显色反应监测互为对 映体底物的水解速率，根据水解速率的差异来评 价酶的立体选择性。这一技术最近被用于荧光假 单胞菌酯酶定向进化中突变体的筛选，得到了立 体选择性明显提高的突变体