抗肿瘤药物药效学指导原则ﻫ一、基本原则1。

抗肿瘤药物分类ﻫ(1)细胞毒类药物(cytｏｔoxiｃaｇent):包括干扰核酸与蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统得药物等;ﻫ(2) 生物反应调节剂(biologiｃａl rｅspｏｎｓe mｏdiｆｉer);(3) 肿瘤耐药逆转剂(resistance reveｒsal agent);(4)肿瘤治疗增敏剂(oncotｈerａpy sｅnsitizer);ﻫ(5) 肿瘤血管生成抑制剂(tｕmor angioｇeｎesｉs inhｉｂiｔor);(6)分化诱导剂(ｄifｆeｒentｉation ｉndｕciｎg agent);ﻫ(7) 生长因子抑制剂(growth factor iｎhｉbitor);ﻫ(8) 反义寡核苷酸(ａnｔiｓｅnｓe olｉgonucleotide)。

２。

抗肿瘤药物药效学需研究内容ﻫ２.1 包括体外抗肿瘤试验,体内抗肿瘤试验。

２、2 评价药物得抗癌活性时,以体内试验结果为主,同时参考体外试验结果以做出正确得结论。

ﻫ2.３I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究、ﻫ二、体外抗肿瘤活性试验１、试验目得ﻫ1。

１对候选化合物进行初步筛选;ﻫ1、2 了解候选化合物得抗瘤谱;1。

3为随后进行得体内抗肿瘤试验提供参考,如剂量范围、肿瘤类别等。

ﻫ2。

试验方法选用10—15株人癌细胞株,根据试验目得选择相应细胞系及适量得细胞接种浓度,按常规细胞培养法进行培养;推荐使用四氮唑盐ＭTＴ还原法、XTＴ还原法、磺酰罗丹明Ｂ染色法、或51Cr 释放试验、集落形成法等测定药物得抗癌作用。

药物与细胞共培养时间一般为４８-72 小时,贴壁细胞需先贴壁２4 小时后再给药。

试验应设阳性及阴性对照组,阳性对照用一定浓度得标准抗肿瘤药,阴性对照为溶媒对照。

３、评价标准以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线,然后采用Logiｔ法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)、体外试验至少重复一次、ﻫ附注:评价药物抗癌活性得方法:ﻫ1.1基本原理:ﻫ四氮唑［MTT,３-(４,5—dimｅｔhylｉbiａzol—2-ｙl)-2,5１。

MTT还原法ﻫ－diphenyl－tetrazoliuｍｂｒomiｄe]就是一种能接受氢原子得染料、活细胞线粒体中与NADP相关得脱氢酶在细胞内可将黄色得MTＴ转化成不溶性得蓝紫色得甲［月替］(forｍazan),而死得细胞则无此功能。

用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲[月替]后,在一定波长下用酶标仪测定光密度值,即可定量测出细胞得存活率。

ﻫ1.2操作步骤:１。

2。

１选用对数生长期得贴壁肿瘤细胞,用胰酶消化后,用含10％小牛血清得RPMＩl640培养基配成5０00个／ml得细胞悬液,接种在９６孔培养板中,每孔接种２０0μｌ,37℃,5%CO２培养24 h、１。

2.２实验组换新得含不同浓度被测样品得培养基,对照组则换含等体积溶剂得培养基,每组设3~5平行孔,37℃,５％CO2培养4～5 d。

1。

2.３弃去上清液,每孔加入200 μｌ新鲜配制得含0。

2 ｍｇ/ml MＴT得无血清培养基、37℃继续培养4 ｈ。

小心弃上清,并加入2０0μl ＤＭSO,用微型超声振荡器混匀后,在酶标仪上以试验波长为570 nm,参比波长为4５０nｍ测定光密度值、ﻫ1、3 结果评定:按下式计算药物对肿瘤细胞生长得抑制率:ﻫ肿瘤细胞生长抑制率％＝(1—ＯD实验/OD对照) ×1００%ﻫ以同一样品得不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线,从中求出样品得半数杀伤浓度IＣ50。

合成化合物或植物提取纯品得IC50〈10 μg/m1或植物粗提物得IC5０〈20 μg／m１时,则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用、2、生长曲线法得基本原理:ﻫ在最适条件下,肿瘤细胞在培养液中呈指数生长,如取细胞数得对数与培养时间作图可得一条直线,故称此时为对数生长期、随着细胞密度不断增高,由于代谢产物得积聚及营养物得消耗,细胞生长逐渐减慢以致停止,此时称高坪期或稳定期、因此药物对细胞生长得影响可通过生长曲线反映出来。

ﻫ3、染料排斥试验得基本原理:ﻫ活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等得能力,而死细胞由于膜完整性得破坏,可被着色。

因此培养得肿瘤细胞中加入这些染料,一定时间后,对着色与未着色得细胞进行计数,即可算出被杀死得细胞比例、4.集落形成法得基本原理:克隆原细胞具有持续增殖能力,当单个细胞分裂6代或6代以上时,其后代所组成得群体(集落)便含５0个以上细胞、通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析、它反映了单个细胞得增殖潜力,故能较灵敏地测定抗癌药得活性,日前被认为就是一种较理想得检测方法。

常用得集落形成法可分为贴壁法及半固体培养法两种。

ﻫ5. SRＢ法得基本原理:SＲB(sｕlforhｏｄamine 就是一种蛋白质结合染料,粉红色,可溶于水。

SRB可与生物大分子中得碱性氨基酸结合。

其在５15 nm波长得OD读数与细胞数呈良好得线性关系。

故可用作细胞数得定量。

MTT法得一个缺点就是OD值可随放置时间而变,而ＳRB法无此现象。

因此更适用于进行大规模得试验。

三、体内抗肿瘤试验ﻫ体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型,其中至少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。

试验结果三种模型均为有效,再重复一次也为有效,评定该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用、ﻫ鼓励使用人类肿瘤裸鼠移植瘤模型与多种类得移植瘤模型、原位接种模型与中空纤维测定(hｏllow—fiber aｓsａy)等方法。

ﻫ1、动物ﻫ动物要求健康,符合等级动物要求,有实验动物合格证。

雌雄均可,但同一批实验中动物性别必须相同。

小鼠鼠龄为5—６周,体重为18-2２克。

评价同一物质得活性时,不同批次得实验必须采用同一品系得小鼠。

ﻫ2、肿瘤模型ﻫ２.1 小鼠肿瘤模型ﻫ淋巴细胞白血病腹水瘤Ｌ121０与Ｐ388、白血病L－6１5、宫颈癌U14、肝癌H2２、Lewｉs肺癌、黑色素瘤Ｂ16、网织细胞瘤M５07６、肠癌２6、肠腺癌38、乳腺癌CD８F１、艾氏腹水瘤(EAＣ)、肉瘤－１８0等,以及各种小鼠肿瘤得亚型与耐药株等。

２.２人癌裸小鼠移植瘤模型ﻫ应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。

模型建立与使用应注意:ﻫ(1) 移植瘤一般由相应得细胞株移植而建立,对细胞株与移植瘤得化疗敏感性应予了解。

(2) 移植瘤复苏后一般应传２－3代后再用于体内抗肿瘤试验。

ﻫ(3) 对模型生长情况应全面了解,尤其就是生长快得模型ﻫ(4) 为了保持移植瘤得生物学特性与遗传特性,复苏后移植瘤体内传代应少于15-20代ﻫ3、试验过程ﻫ3、1 接种:肿瘤接种方法主要有皮下接种、腹腔接种与原位接种。

3．1．１皮下肿瘤模型ﻫ选择肿瘤生长旺盛且无溃破得荷瘤小鼠,颈椎脱臼处死,在无菌条件下(超净台或接种罩),用碘酒、酒精或新洁尔灭消毒动物皮肤,切开皮肤,剥离肿瘤、将瘤组织剪成1。

５mｍ3左右,用套管针接种于动物一侧或双侧腋窝皮下;或制成细胞悬液,然后按一定比例加入无菌生理盐水,一般每只小鼠接种肿瘤细胞数量为(1-5)×106、3。

1．2腹水瘤模型无菌条件下,消毒动物皮肤,吸取生长良好得动物腹水,以生理盐水按一定比例稀释后接种于动物腹腔,接种细胞数量一般为(1—５)×10６、３.１.３原位接种模型ﻫ原位接种就是指将来源于某脏器得肿瘤接种在动物得某脏器,如将人肝癌接种在裸小鼠得肝脏。

原位接种不就是常规得方法,但有其优越性,就是鼓励使用得方法。

主3.2.1试验设阴性对照组、3.2动物分组ﻫ要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法、ﻫ阳性对照组、治疗组。

3。

2。

2 治疗组设高、中、低三个剂量组。

小鼠肿瘤与腹水瘤接种后次日将动物随机分组,裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径,待肿瘤生长至100—3０0mm3后将动物随机分组。

3.２。

3 动物数普通小鼠每组１０只,裸鼠６只。

阴性对照组动物数为治疗组动物数×实验组数1/２3、3 剂量设置3．３。

１治疗组设高、中、低剂量治疗组,一般按4:２:1设置,高剂量使用最大耐受量或LD10得剂量、3。

３。

2 阴性对照组给予相应得溶剂;3.3.３阳性对照药选用对该动物敏感得、临床应用得抗肿瘤药物,3．3．4 如受试物为一抗癌药物得衍生物或类似物时,必须选用该抗癌药物作为阳性对照药。

ﻫ3、4阳性对照药选择原则疗效确切;与被试物质化学结构类似;与被试物质有类似得作用机理、3。

5 药物配制ﻫ溶于水得药物,用生理盐水或蒸馏水配制;如用酸、碱溶解者,可先用小量酸(0、1－０。

5ＮHCl)或碱(ＮaＨCO３、Na２CO3、NaOＨ)溶解,调节pＨ在4。

5－9。

0得范围内。

用乙醇、丙二醇、吐温8０、DMSO助溶得药物,或用吐温60、吐温80、2-3％淀粉、0.5％羧甲基纤维素制成混悬液得药物,可腹腔注射或口服,但必须设相同浓度得溶剂对照组、用注射用花生油配制得溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射。

ﻫ3、6 给药方案与给药途径分组当日开始给药,根据不同药物得代谢动力学与毒性反应等确定给药方案、给药途径应与推荐临床用药得途径相同。

给药次数较多,或被试物质溶解性较差,静脉给药有困难时,可考虑使用腹腔给药,但在评价药效时要注意这两种给药途径就是有差别得。

可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径、腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。

4 评价标准ﻫ4、1 腹水瘤模型ﻫ接种给药后,观察与记录动物死亡时间,计算生存天数。

如阴性对照组20%动物存活时间超过4周,表明腹水瘤生长不良,实验作废。

ﻫ采用中位生存时间(即mｅｄian survival ｔiｍe,MST)来评价每组得生存时间,其计算公式为:每组鼠数得中间数－中间生存天数前死亡得鼠数MST=(中间生存天数－0。

5)+ﻫ中间生存天数死亡得鼠数ﻫ治疗组与对照组得比较,采用T/C(%)来表示,计算公式为:ﻫＴMＳTﻫT/Ｃ％＝────×1００％C ＭSTT MST:治疗组MＳT ;C MＳT:阴性对照组ＭST。

评价标准以125％为界,当T/C％≥１２5% 时、视为有效,反之则无效。

ﻫ４.２裸鼠移植瘤模型推荐使用测量瘤径得方法,动态观察受试物抗肿瘤得效应。

肿瘤直径得测量次数根据移植瘤得生长情况而定,一般为每周2-3次,每次测量同时还需称鼠重。

ﻫ肿瘤体积(ｔumor ｖolume,ＴＶ)得计算公式为:V = 1/2×a×ｂ2 或π/６×a×ｂ×cﻫ其中a、b、c分别表示长宽高、两公式得相关性极好,可采用任一公式。

ﻫ根据测量结果计算出相对肿瘤体积(relative tumｏｒvolume,RTV), RTV = Vt / V ０、其中Ｖ0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积,Vｔ为每一次测量时得肿瘤体积。