2002 年---美国匹兹堡癌症研究院大学(University of Pittsburgh Cancer Institute (UPCI)) 的 Son 也研发出一种超大量 BMDC 培养方法，称为 bulk-culture method。该法每只小鼠可获 得的 BMDC 的数量是 Inaba 经典方法的 7-10 倍，即 3 – 4 x 107 个 BMDC，而且培养时间 与 Inaba 经典方法相似，仅需 7 天[9]。 1. 2. 3. 4. 骨髓取出后仅溶血，不做任何其它处理； 使用6孔培养板培养； 培养过程中使用GM‐CSF+IL‐4联合诱导； 培养的第4天和第7天补加足量的GM‐CSF和IL‐4。
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【BMDC 培养的发展简史】
1973 年 ---加拿大籍科学家 Raplph M. Steinman 在美国洛克菲勒大学 (Rockefeller University)工作时从小鼠外周淋巴器官(脾、淋巴结和派氏集合淋巴结)中首次鉴定出树突状 细胞(Dendritic Cells, DC)[1]。Steinman 也因此获得了 2011 年诺贝尔生理学或医学奖。 1992 年---日本京都大学(Kyoto University)的 Inaba 在添加 GM-CSF(粒细胞/巨噬细胞集 落刺激因子)的情况下，分别成功从小鼠血液和骨髓细胞体外诱导出大量的 DC[2,3]。因此， Inaba 被认为是小鼠 DC 体外培养的创立者，且 Inaba 法被称为小鼠 BMDC 培养的经典方 法。 1. 这些工作均是在Ralph M. Steinman的参与下完成的； 2. Inaba培养的BMDC来源于小鼠股骨和胫骨中的骨髓； 3. Inaba先用抗体+补体法去除骨髓中的淋巴细胞，以防淋巴细胞对 BMDC培养的影响； 4. 在诱导分化过程中，为防止粒细胞的干扰，Inaba通过每2天轻摇培 养板并3/4体积换液的方法来尽量去除粒细胞； 5. Inaba证实单用GM‐CSF通过6‐8天的培养，即可从骨髓细胞诱导得到 大量的DC细胞，而且混合淋巴细胞反应提示其为成熟的DC细胞； 6. 该法可从一个小鼠的骨髓中培养获得 5‐7 x 106个DC细胞。
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1. 骨髓不作任何预先处理； 2. 使用细菌培养皿(Petri Dish)替代细胞培养板； 3. 细胞的初始铺板密度低，为2 x 105/ml； 4. 培养时间延长至10‐12天； 5. 仍仅用GM‐CSF诱导，但第8天或第10天后减量使用； 6. 第6天和第8天半量换液，但吸出的悬浮细胞离心后放回原板。
【经典的 BMDC 培养法】-Inaba 法(改良)[3,10] 背景：
1. Inaba 法获得的 BMDC 数目为 5-7 x 106 个/小鼠； 2. Inaba 原法操作比较复杂，需要将骨髓中的淋巴细胞等用抗体+补体法预先去除， 后来的改良法均省却了这个步骤，其实 Inaba 后来自己也说这个步骤虽然可提高 BMDC 的纯度，但不会对 BMDC 的生成产生影响，可做可不做[10]； 3. Inaba 原法仅用 GM-CSF 来诱导 BMDC 的产生，虽然得到的 BMDC 在混合淋巴 细胞反应中有较强的刺激能力，但 DC 的成熟度不及 GM+IL-4 的联合诱导，所以 后来的改良法中多用 GM+IL-4 联合诱导。
收集DC，重新铺板， 以促进DC更成熟
加入以下任意一种成熟诱 导剂： 1. rmTNF‐ (25‐50ng/ml) 2. LPS (1g/ml) 3. rmCD40L (1g/ml)
【前 言】
原递呈细胞 (Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC 是唯一能够显著刺激初始 T 细胞 (Naï ve T cells)增殖的 APC，而其它种类的 APC(如单核巨噬细胞，B 细胞等)仅能刺激已活化 的或记忆性的 T 细胞，因此 DC 是机体适应性 T 细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中也 发挥着极其重要的作用。 虽然 DC 存在于体内多种组织中，但含量很少，无法满足科学研究和临床治疗的需要， 所以人们尝试多种方法来体外培养和扩增 DC。对于人，最常用的方法是从人外周血单个核 细胞(PBMC)诱导 DC 的产生。而对于小鼠，最常见的方法是从骨髓细胞诱导产生 DC，即骨 髓来源的 DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。 鉴于功能分析和分子生物学研究的需要，获得更高数量和更高纯度的 BMDC 是大家一 直追求的目标，本文将与大家分享 BMDC 的经典制备方法和大量制备法，大家可根据自身
1 详情请致电授权经销商——杭州联科生物技术股份有限公司 中国杭州拱墅区祥园路108号 智慧信息产业园三期3号楼13层 全国免费客服电话：400-6721-600 邮箱：service@
D
C 是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出 许多树突样或伪足样突起而得名。DC 是由 2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大 籍科学家 Ralph M. Steinman 于 1973 年发现的[1]，是目前发现的功能最强的抗
培养步骤：
1.
1.1
小鼠骨髓细胞的获得
小鼠(6 - 10 周龄)颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨(femurs)和胫骨(tibias)， 并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净；
注：不要损伤到骨。
1.2 1.3 将骨移至超净台内，并用盛有 70%酒精的无菌培养皿浸泡 2-5min，以消毒灭 菌，然后用无菌的 PBS 洗 2 次； 将骨移入另一个盛有 PBS 的新培养皿中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽 取 PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至 骨完全变白； 1.4 1.5 1.6 收集骨髓悬液，用 200 目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织； 滤过液 1200 rpm 离心 5min，弃上清； 加入 2 ml 氯化铵红细胞裂解液(1x)，重悬细胞，室温孵育 3-5min，最长 10min； 氯化铵红细胞裂解液的配制： 1. 先配制10x的贮存液，配法如下： 称取82.9g NH4Cl，10.0gKHCO3和0.37g Na2EDTA，溶于1L的蒸馏 水中，0.22m滤膜过滤除菌，4oC储存6个月；
1994 年---奥地利因斯布鲁克大学(University of Innsbruck)的 Romani 等发现 GM-CSF 和 IL-4(白细胞介素 4)联合诱导，可从人血液 PBMC(外周血单个核细胞)制备出大量的 DC，而 GM-CSF 单独诱导的效果不好[4]。后来，科学家也将 IL-4 应用于小鼠 BMDC 的培养[5,6]。 1999 年----德国明斯特大学(University of Munster)的 Labeur 研究表明，单独用 GM-CSF 诱导的 BMDC 为未成熟 DC(immature DC, iDC)，GM-CSF 和 IL-4 联合诱导出来的 BMDC 的成熟度居中，添加 CD40L 或 LPS 可进一步诱导 DC 完全成熟，即成熟 DC(mature DC, mDC)[7]。 1999 年---德国埃尔朗根大学(University of Erlangen)的 Lutz 开发出一种可获得超大量 BMDC 的方法，每只小鼠可获得的 BMDC 的数量是 Inaba 经典方法的 50 倍之多，达 1-3 x 108 个 DC 细胞/小鼠[8]。该法被 DC 研究者广泛认可和使用。
摘自文献 Inaba K, et al. J Exp. Med. 1992; 176(6):1693-702 [3]
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摘自文献 Son YI, et al. J Immunol Metods. 2002; 262(1-2): 145-57 [9]
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2.3 每 2 天轻轻摇晃培养板，然后 3/4 体积更换新鲜培养液，并补足细胞因子。
注：1)此步骤的目的是去除粒细胞和淋巴细胞，因粒细胞和淋巴细胞为悬浮生 长； 2) Inaba 认为培养的前 4 天，大部分 DC 贴壁仍较牢，所以此法不会大量 损失 DC； 3) 若发现损失的 DC 细胞过多，可仅在培养的第 2 天用此法换液； 4) 在培养的第 4 天，可以看到聚团生长的 DC 贴附于板底，第 6 天则可 观察到很多 DC 成集落生长。
小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的培养
主要目次
【经典的 BMDC 制备方法简图】--------------------------------------------- 1 【BMDC 培养的发展简史】--------------------------------------------------- 2 【经典的 BMDC 培养法】-Inaba 法(改良) ----------------------------------4 【BMDC 大量制备法】-Son 法-------------------------------------------------6 【BMDC 大量制备法】-Lutz 法------------------------------------------------7 【注意事项】----------------------------------------------------------------------9