1、超速离心法


原理: 利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使 具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯 度层内，达到彼此分离的目的。 应用： 用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗 原物质的分离，如IgM、载脂蛋白A、B等。
2、选择性沉淀法
原理： 根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉 淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀， 从而达到纯化的目的。 常用方法： 盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解度不同）， 常用33～50％饱和度的硫酸胺。 特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。 应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。
特异性IgG抗体的纯化
1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐析提取γ球蛋白 3次，基本为IgG类抗体，但不纯。 2.A蛋白亲和层析：SPA与IgG的Fc段有很强的 特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地 与抗体结合，一个A蛋白至少可以结合二个 IgG分子。适合纯化细胞培养上清中的McAb。 3.其它：凝胶过滤、离子交换层析等
— + + + —
— + + —
— +
—
+
+ + + +
+ — — — + — — + + +
离子交换层析
5、亲和层析法
• 原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的 技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制 成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的 IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)
结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗
脱下来，达到纯化的目的。 • 优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。
亲和层析法示意图
正常细胞 标记细胞 ＋ 洗滴 标记细胞 加入特异 其它蛋白 被酶裂解 性抗体 洗涤流失 SDS-PAGE 分离蛋白
亲和层析
抗原的鉴定
1.含量鉴定：凯氏定氮法 2.理化性质鉴定 ①凝胶层析技术测定 ②聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③凝胶管状电泳 ④超速离心 3.纯度鉴定 常用醋酸纤维膜电泳 4.免疫活性鉴定 常用双向琼脂扩散试验
③为制备出高效价的免疫血清；
⑤在某种情况下，改变Ag免疫应答类型；
⑥延长抗原在免疫动物的时间；
⑧增强局部对变应原的超敏反情况。
人工抗原及基因工程抗原


用化学合成法或基因重组法制备含有已知化学 结构决定簇的抗原，称之为人工抗原。 它可包括人工结合抗原、人工合成抗原和基因 重组抗原。
人工合成抗原

特异性抗体的鉴定
1.抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定
2.抗体特异性鉴定 ①细菌类抗原的抗体用凝集试验 ②可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验 3.抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法 4.抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好
亲合力



亲合力是指抗体与结合抗原的活度或牢固度。抗体与 抗原结合疏松，结合后会迅速解离，称为亲合力低， 反之，亲合力高。 亲合力的高低是由抗原分子的大小，抗体分子的结合 位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决 定的。 亲合力常以亲合常数K表示。K的单位是升/摩尔 （L/mol）。 在RIA中，K是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度） 的倒数，K=1/[H]，[H]是最小检出量，通常，K的范围 在108～1012L/mol之间。
常用佐剂的种类及制备
（二）常用佐剂的种类和制备
1.氢氧化铝佐剂：
5%硫酸铝
强烈搅拌
氢氧化 NS 洗 5%氢氧化钠 二次 铝沉淀 NS 制成悬液 即为佐剂
等体积抗原
免疫接种
2.明矾佐剂
抗原 NS搅拌 氢氧化钠校正pH值至6.5 沉淀 NS洗 二次 离心 乳状悬液
10%硫酸钾铝
防腐剂
备用
* 明矾佐剂抗原常用于肌肉注射，皮下注射
融破。
• 特点：适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。
3、超声破碎法
原理： ①利用超声波的机械振动而使细胞破碎。 ② 超声波使用的频率从1kHz～20kHz， ③间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。 特点： ①操作简单，重复性较好，节省时间； ②多用于微生物和组织细胞的破碎。
4、表面活性剂处理法
小结

抗原的种类 颗粒性抗原的制备 可溶性抗原提取分离纯化方法 抗原的鉴定 半抗原免疫原的制备 佐剂的作用
第二节 抗体的制备

多克隆抗体的制备 单克隆抗体技术 基因工程抗体
多克隆抗体的制备

1.免疫动物选择 2.免疫方法 3.动物采血法 4.免疫血清的分离及保存
半抗原-载体连接方法1
碳化二亚胺法：
混合
半抗原＋载体蛋白质 搅拌1～2h
R-NH=CH-R’
透析除去未反 应的半抗原
室温24h
人工免疫原
戊二醛法:
半抗原-NH2 载体蛋白-NH2
半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-载体蛋白
OHC-(CH2)3-CHO
混合
*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双
3、凝胶层析法
• 原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适 当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不 一的混合物加在凝胶床面时，由于分子大小的不同先 后被洗脱出来，从而实现对不同分子大小的物质进行
分离。
• 常用的如：如葡聚糖凝胶填料（sephadex 柱）
凝胶层析（分子筛）
4、离子交换层析法
半抗原免疫原的制备
1.半抗原： 低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、 脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及其 他化学物品等。 2.载体：蛋白质类 多肽聚合物 大分子聚合物 3.半抗原-载体连接方法
载体类型
1.蛋白质： 人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛 甲状腺球蛋白等。 2.多肽聚合物： 人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大 （可达十几万到几十万)，这种多聚物和半抗原结合后， 可刺激免疫动物产生高效价、高亲和力的抗体。 3.大聚合物： 羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，可与半抗原结 合，加入弗氏完全佐剂亦可诱发动物产生抗体。
半抗原-CH2OH
吡啶
CH2-CO
CH2-CO
带羧基的半抗原 琥珀酸衍生物
半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH
再经氯甲酸异丁脂法或碳化 二亚胺法制备载体半抗原
佐剂
概念： 能非特异地通过物理或化学方法与抗原结合从而增强 其特异性免疫原性的物质。 条件： ①增加抗原的表面积； ②改变抗原的活性基团构型； ③佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间； ④可直接或间接激活免疫活性细胞 ； ⑤无毒性或无副作用。
免疫血清的分离和保存
免疫血清的分离 1、室温自然凝固，然后放置37℃或4℃待凝 块收缩，分离血清。 2、 抗血清分出后要经56℃30min灭活。 免疫血清的保存 1.4℃保存：可保存3～6个月 2.低温保存：-20～-40℃，可保存2～3年 3.冰冻干燥保存：可保存3～5年
特异性抗体的纯化
1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose 上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层 析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异 性抗体。 2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上 清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。
免疫动物的选择

能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵 羊、豚鼠、鸡、山羊和马。 免疫动物的选择原则：
1.抗原与免疫动物种属差异越远越好； 2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、 体重合乎 要求； 3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答； 4.按需要量选择大小不同的动物。
免疫方法
功能联接剂
半抗原-载体连接方法3
氯甲酸异丁脂法： 半抗原-COOH Cl-COO-CH2CH(CH3)2
半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2
载体蛋白-NH2
半抗原-CO-NH-载体蛋白 ＋ HO-CH2CH(CH3)2 简便，用于类固醇抗原制备
半抗原-载体连接方法4
琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备

细胞的破碎 分离纯化
细胞的破碎 1.酶处理法 2.冻融法 3.超声破碎法 4.表面活性剂处理
1、酶处理法
常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 特点： ①适用于多种微生物； ②作用条件温和； ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。
2、冻融法
• 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂 浓度的突然改变而破坏细胞。 • 方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化， 如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被
单克隆抗体技术
单克隆抗体：由B细胞杂交瘤产生的只识别抗原 分子上一种抗原决定簇的抗体分子。
杂交瘤技术的原理及流程




HAT培养基是含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷 (T)和甘氨酸的完全培养基。在氨基蝶呤(二氢叶酸类 似物)存在下，这种酶缺陷的细胞不能通过核苷酸合成 旁路合成次黄嘌呤和胸苷。 制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转 化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B 细胞融合。 融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸 核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基 喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。 B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二 周内均死亡。 PEG：聚乙二醇
颗粒抗原的制备
1、血红细胞抗原的制备： 动物的新鲜血液+抗凝剂 离心去上清 NS悬浮 离心洗涤三次（2000转/分）
绵羊红细胞的制备流程图
摇动15-20min
4℃
可 保 存 3 周
NS稀释至
2～5%