端粒和端粒酶研究及应用黄品清10102106摘要：端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构 ,由端粒DNA和端粒相关蛋白组成 ,它能维持染色体的结构稳定和功能 ,保护其免受核酸酶降解 ,防止其末端融合或重排等。

当端粒长度因细胞复制而缩短到极限时，细胞就会走向衰老甚至死亡，而端粒酶的存在能补充已缩短的端粒从而延长细胞寿命甚至使其得到永生。

端粒(telomere)是染色体末端的特殊结构，它的存在及其特殊构象的维持，是保护线性染色体末端、顺利完成DNA末端复制所必需的。

端粒具有稳定染色体末端、解决末端复制不完整等多重功能。

端粒酶(telomerase)是对抗正常复制过程中端粒的缩短、维持真核生物染色体长度的关键酶，在肿瘤细胞中表达尤为强烈。

自“端粒缩短是触发细胞衰老的分子钟”的假说提出后，科学家们已通过实验提供了大量证据来证明该假说，随着对端粒和端粒酶的结构和功能研究的深入，它们成为国内外研究的热点之一。

一、端粒的结构和功能端粒(telomere)是保护真核细胞染色体末端并维持其完整的特殊的DNA／蛋白质复合物，它像“帽子”一样扣在染色体的两端，从而维护染色体的完整性和稳定性，防止染色体被降解、融合和重组，便分裂后得到的子代细胞能准确的获得完整的遗传信息．1、端粒DNA的结构端粒DNA由两条长短不同的DNA链构成，一条富含G，另一条富含C。

富含G的那条链5’一3’指向染色体末端，此链比富含Cc的链在其3’末端尾处可多出12～16个核苷酸的长度，即3’悬挂链(3’overhangstrand)，一定条件下能形成一个大的具有规律性很高的鸟嘌呤四联体结构，此结构是通过单链之间或单链内对应的G残基之间形成Hoogsteen碱基配对，从而使4段富含G的链旋聚成一段的四链体DNA。

也有人认为，端粒G链序列可以形成稳定的发卡结构，它和四联体结构都被认为与端粒DNA的保护功能有关。

不同物种端粒的重复序列和长度是不一样的，人类的端粒DNA由[5’一TTAGGG一3’]反复串联而成，不具有编码任何蛋白质功能，进化上高度保守，总长度约5一15kb，随着每次细胞分裂的进行，染色体末端丢失50一200bp。

2、端粒结合蛋白的结构端粒结合蛋白包括端粒酶、保卫蛋白复合体(sheherin)和非保卫蛋白。

保卫蛋白复合体由端粒重复序列结合因子l(TRFl)，端粒重复序列结合因子(TRF2)。

端粒保卫蛋白1(P0rrl)，TRFl相互作用核蛋白(TIN2)，TIN2相互作用蛋白l(TINTl)及阻抑和活化蛋白1趣印1)组成，各分布在染色体端粒上，能保持端粒结构的相对稳定。

非保卫蛋白有DNA修复蛋白RADSONBSl。

胍E11，Ku86和DNAPKcs等，各分布不局限在端粒上。

这三类端粒结合蛋白协同参与端粒动态平衡的维持和调节。

3、D-loop—T-loop结构假说1999年Griffith等提出端粒结构的D-loop—T一100p假说。

端粒的3’突出部侵入到端粒重复序列后形成T—loop，同时通过单链G尾的TTAGGG在环的端口内侧与CCCTAA碱基互补形成100～200碱基对的D-loop。

T一100p的形成为端粒的保护作用提供了一个结构基础，并很好地解析了端粒对染色体的保护作用，因为端粒缩短到极限长度时已无法形成T-loop，使端粒失去了保护功能。

染色体不能完整地复制导致细胞死亡。

4、端粒与细脆衰老病关系的新假说2000年Blackbern提出了新的端粒与细胞衰老关系假说：端粒在正常的细胞分裂时能动态地从戴帽状态向非戴帽状态来回变换，处于前者时，细胞能继续分裂，处于后者则会引发细胞周期阻滞。

当一定量的端粒因多次分裂而缩短到不能形成戴帽状态时，细胞将走向衰老甚至死亡。

而激活端粒酶后。

端粒便能以同源重组的式使非戴帽状态返回到戴帽状态，逃回过复制衰老而继续分裂。

这个假说与端粒的D-loop—T-loop帽子结构可以说是相互呼应，因为T—100p的形成需要一定长度的端粒。

从另一个角度说，端粒的进行性缩短使其难以恢复戴帽状态。

由于3’悬挂末端的丢失会引起T-loop结构的破坏，导致端粒末端的非戴帽状态。

因此，stemart等提出，3’悬挂末端的丢失才是触发复制衰老的信号，揭示了与衰老相关的端粒结构改变分子学机制。

5、端粒在生物体中的功能目前认为端粒的主要功能包括：（1）保护染色体末端防止被核酶降解或被化学修饰或融合以及非正常重组，维持其完整性；（2）与其中蛋白质共同参与染色体的定位和复制，使细胞得以正常分化或繁殖；（3）反映细胞分裂的能力与寿命。

事实证明，大多细胞的端粒长度与细胞的分裂能力有关，越长分裂能力越高，反之亦然。

我们也能通过细胞的端粒长度和分裂一次端粒缩短的长度来估计细胞的寿命去挑选合适的细胞做相关的研究。

二、端粒酶的结构和功能端粒酶于1984年由shpay等发现，它是由端粒酶RNA链和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，直接参与端粒的形成，是一种能将真核生物染色体末端DNA加以延长的核酸蛋白复合物。

1、端粒酶的结构成分端粒酶包括3个组分：端粒酶RNA(telomeraseRNA，TR)，端粒酶相关蛋白质1(telomeraseassociated—proteinl，TPl)，端粒酶催化亚单位(TelomeraseReverseTranscriptase，TERT)。

2、各成分的特点hTR即人类端粒酶RNA，是人类端粒酶合成端粒DNA的模板，它是端粒酶发挥作用所必须的。

由于正常体细胞中都会存在hTR，却几乎没有端粒酶的活性，而且在多种肿瘤细胞中测得的hTR与端粒酶活性也不平行,因而它不能反映端粒酶活性高低。

TPl在端粒酶活性的调节中有重要作用，但有证据表示它不是端粒酶发挥活性作用所必须的。

hTERT是含有7个基元的转录酶，在端粒酶的激活中起关键作用，在无细胞的情况下将hTR和hTERT混合在一起即可表现端粒酶活性，是端粒酶活性的限速亚单位。

hTERT删A水平与端粒酶的活性成正相关：将载有hTERT基因的质鹅转染端粒酶隐性的成纤维细胞，可重建端粒酶活性：使hTERT基因突变，细胞则不表现端粒酶活性。

同一组织的不同部分，细胞分裂能力与端粒酶活性成正比，如在毛发生长初期的毛囊中，含有分裂活性细胞的部分表达端粒酶活性，而低度分裂活性细胞部分则表达较低水平的酶活性。

3、端粒酶的主要功能目前认为端粒酶的主要功能是维持染色体末端的端粒序列，即延长端粒DNA富含G的链，使其形成G～四联体或发夹结构。

保护染色体。

端粒酶还能修复已断裂的染色体末端，从而抵消因细胞分裂而导致的端粒DNA的消耗，维护遗传信息的完整性。

此外，端粒酶能合成串联重复的TTAGGG序列，这提供了TRF2结合位点，有助于防止染色体末端的融合。

三、端粒系统与癌症端粒酶可能在癌细胞的生长过程中扮演重要角色。

加州大学旧金山分校的研究人员发现黑素瘤的扩散能够通过抑制端粒酶的活性来阻止。

这项研究首次将端粒酶与糖酵解联系在一起。

糖酵解是身体中消耗葡萄糖并产生乳酸的糖代谢途径。

端粒酶和糖酵解关系的确立对了解端粒酶和糖酵解的功能产生很大的影响。

这项新发现支持了通过抑制端粒酶来治疗癌症的基本原理。

在这项研究中，研究人员通过对小鼠的基因表达进行分析，发现皮肤癌细胞中8个与葡萄糖代谢有关的基因在细胞中端粒酶被抑制时，表达水平降低了。

他们发现，当将一种端粒酶抑制剂引入到黑素瘤细胞中时，黑素瘤细胞开始发生变化，细胞恢复了以前的丧失的功能，如产生色素的功能。

由于乳酸的积累会使细胞变得很酸，控制色素生产的蛋白质能够被关闭--这意味着葡萄糖代谢当与转移性肿瘤的端粒酶联合起来时起到一个关键的作用。

正常细胞中，端粒是每个染色体末端的单练DNA，并且会随着细胞的分裂逐渐缩短。

端粒酶在发生异常的细胞如癌细胞中被活化，它能恢复端粒长度并使它们分裂和生长。

因此，端粒酶在90％的人类癌症中发生了过表达。

美国德州大学西南医学中心的Woodring Wright 教授的研究组发现人类染色体末端的DNA即端粒结构有助于治疗癌症。

端粒与细胞分裂有关，它会随着细胞分裂逐次缩短，同时也意味着细胞的衰老。

但是，许多癌细胞都含有一种叫做端粒酶的特殊酶。

这种酶能够延长端粒的长度，从而破坏了端粒随细胞分裂不断缩短的自然规律，使细胞得到永生，即细胞无控制地进行扩增疯长--癌细胞的特征。

研究人员推测，能够影响此机制的药物将可能用于减缓正常细胞的老化、抑制端粒酶活性来治疗癌症。

而且对端粒长度的控制机制的了解，可能促进癌症的治疗。

Wright 教授和Jerry Shay 教授已经研发出有助于延缓老鼠体内肺癌细胞扩散的抗端粒酶药物，并且目前正进行人体试验以确定其安全性。

研究人员还指出抗端粒酶药物还需要与其它手段联合使用才能有效治疗癌症：这类药物将可能作为手术或化疗等传统疗法之间的连接，从而防止未被杀死的癌细胞扩散身体的其他组织中去。

四、端粒系统与衰老衰老是生物在生命过程中整个机体形态、结构和功能逐渐衰退的综合现象。

生物的机体由细胞构成，生命存在于活细胞中，故生命的衰老起始于细胞。

单细胞真核生物中的端粒长度必须一直维持，而人类细胞在正常情况下是非永生的，其端粒在许多体细胞中较短。

GryfeR等于1997年提出了关于细胞衰老和永生学说，认为人的正常体细胞分裂次数达到界限时，染色体端粒长度缩短到一定程度，有丝分裂便不可逆地被阻断在细胞周期的G1期和G2/M期之间的某个时期，这时的细胞便进入了老化期，随后死亡。

如果细胞被病毒感染，或p53、RB、p16INK4、ATM、APC等肿瘤抑制基因发生突变，或Kras 等原癌基因被激活，或DNA错配修复基因(如hMSH2等)发生突变，或某些基因DNA序列发生了高度甲基化，或仅发生了低度甲基化，从而(在未发生核甘酸突变的情况下)改变了该基因的表达，此时细胞便能越过阻断点继续进行有丝分裂。

随着有丝分裂进行，端粒长度不断缩短，缩短到一定程度时，染色体发生结构畸变，大部分细胞便死亡，少部分细胞激活了端粒酶活性，不断合成端粒DNA补充端粒的长度，端粒不再缩短，细胞便获得无限分裂增生能力而成为永生化细胞。

这说是端粒-端粒酶假说该假说已为越来越多的研究所证实。

如Hastie发现人结肠端粒限制性片段(TRF)随着供体年龄增加而逐渐缩短，平均每年丢失33 bp 的重复序列。

Allospp等用人成纤维细胞研究端粒长度与年龄及有丝分裂能力的关系时也发现，年龄越小，初始端粒长度越长，有丝分裂能力亦越强；反之，在一些早老性疾病患者体细胞中，TRF长度明显短于同龄正常人，体外培养这些细胞时，其有丝分裂能力较正常人也明显减弱。

杨仕明等人在分析正常人胃粘膜TRF长度时，也得出相似的结论，随着年龄的增加，其TRF长度有递减的趋势，且供体年龄与TRF长度呈明显负相关(r=0.05，P<0.01)，端粒重复序列每年平均丢失（41±12）bp左右。