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“螺旋讲堂”2008年第十一课----“基因启动子分析基本流程”
螺旋
亲爱的螺友们，大家好！欢迎光临螺旋讲堂，很高兴有机会和大家相聚螺旋网，让
我们一同在讨论中学习，在交流中成长！
分子生物学发展迅猛，新方法新技术新发现层出不穷，但是我想,我们的基础研究从
某种意义上来说，可以简单的分为两大部分，一个是基因的表达，另一个是基因的功能。当
然，这个基因的概念现在已经不仅仅是指编码蛋白的DNA序列了。
我们这期主要探讨基因的表达。而转录调控在基因表达中占有很重要的地位。基因
的转录调控机制非常复杂，这些理论有机会我们再详细探讨，这里就不多介绍了，我们主要
谈一下对于一个新的基因，如何开始他的转录调控研究，第一步到底该怎么做呢？
这里提供一些简单的入门级别的方法，希望对大家有用。相信还有更多更好更实用
的方法，也希望螺友们能够拿出来和大家分享，共同进步！
本次讲座共分为五个部分主要是讲第一部分,因为这个一般的文献和书籍都很少有
详细说明.
一：克隆目的基因基本启动子序列
我们都知道，基因的基本启动子一般是在基因转录起始位点上游，当一个基因在没有
确定其转录起始位点的时候，我们假定NCBI上提交的序列就是他的完整转录本，那么他的
第一个碱基就是他的转录起始位点。而基因的基本启动子一般就是在转录起始位点的上游
2000bp左右和下游200bp左右，当然,这个是一般情况,具体问题还要具体分析.尤其现在发
现一般的基因都是有几个转录起始位点的.
我们通过该基因mRNA序列和基因组序列BLAST，就能够在染色体上找到这段基因
组序列。我这里用human的AGGF1基因做个例子给大家具体演示一下.
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1 首先需要在NCBI里面查找到AGGF1基因的mRNA序列,这个我想大家都应该很清楚,如
下图.
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2 然后就是用这段mRNA序列和人类的基因组序列BLAST
上面那个最匹配的结果。
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4 点击之后就可以看到下图，这个基因的14个外显子和13个内含子在5号染色体上的位置一
目了然，第一个外显子在上面，说明这个基因在染色体上是正向的，基本启动子就应该在第
一外显子上面，我用红色的方框标明了。
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5 大家有没有注意到左上方有个数据框，我把数值改为76,360K 到 76,362.200 ,刚好
2200BP,包括了第一个外显子的前200BP左右.
然后点击红色框标明的Download/view sequence.
6 然后就到了这个界面, Sequence Format 选择GenBank, 然后点击 Display. 就得到我
们所需要的序列了.
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7 这里我们可以看到1989到2201是AGGF1的mRNA序列,说明我们的确找到了该基因5'非
翻译区的上游启动子序列.建议将这2200bp都克隆下来..
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以上的步骤就是基因基本启动子的查找,其实还有很多调控序列是在基因内含子区域或者是
基因的3'非翻译区等,序列查找的步骤和上面是一样的.
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8 还有一个方法更加简单,那就是用AGGF1的 前60bp序列和nucleotide 数据库 BLAST,
可以得到该序列在染色体上的位置,需要注意的是,如果是反向的序列的话,我们就要选择反
向互补的序列.
相信大家在使用的过程中会有更多的发现.
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二：软件预测顺式作用元件，做点突变分析
得到这些序列后,克隆进没有启动子载体pGL3或者pTAL-luc中去，转染细胞, 测定
荧光活性，如果有很强的活性,那么说明你已经成功克隆到了该基因的基本启动子.
然后可以通过5‘非翻译区一系列的缺失突变，不断把范围缩小,找到哪一段序列对于
该基因的启动子活性是必须的或者是最重要的。
分析,得到的结果并不都是可靠的,每个软件
果,并通过分析预测出来的转录因子是不是
续做下面的验证实验。
下面这两个有商业化的软件，有条件的朋友可以用。
http://www.genomatix.de/
http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html#transfac
下面这两个是免费的，用起来很方便。
http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html
http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess
我用TESS举个列，直接在首页下面的方框里输入你要分析的序列就可以了。
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同样在首页，通过下面的方框，你可以查找一些转录因子的相关信息.
就可以用重叠延伸PCR的方法针对几个最
有时候,你可以突变2-3个碱基,这样有效果会更好.
同时突变避免形成新的转录因子的结合位点,提交引物之前把突变后的序列也要通过
上面的软件预测一下.
以下的相关实验都有试剂盒,并且说明书都写的非常详细,实验步骤就不多说了,主要
说明下面该做哪几个实验,以及该实验的意义.
三：EMSA实验在体外验证顺式作用元件同反式作用因子的结合
反式作用因子一般指的就是转录因子,顺式作用元件一般是指转录因子和启动子结合
的那部分序列,一般是10-20bp左右.
点突变证实该顺式作用元件对于启动子活性是有影响的,接下来就要用EMSA实验验
证反式作用因子和该顺式作用元件在体外是有直接结合的.,反式作用因子可以用细胞核抽
提物做，也可以用体外表达纯化的蛋白，也可以用该反式作用因子的抗体做Super shift 实
验，进一步证实该证顺式作用元件同反式作用因子的特异性结合。
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四：CHIP实验在体内验证顺式作用元件同反式作用因子的结合
当EMSA实验得到阳性结果后,还是不能最后肯定该反式作用因子和该顺式作用元件
有结合.毕竟体外的结合并不能代表生理条件下的结合.接下来就要用染色质免疫沉淀(ChIP)
技术来证实在体内的生理条件下该顺式作用元件和该反式作用因子是有结合的.
五：过表达和干扰反式作用因子情况下用RT-PCR验证目的基因的表达情况
那么,反式作用因子和顺式作用元件有结合,就一定会影响该基因的表达吗?很多时候
很多转录因子一起形成复合体才有调控作用,于是我们要在过表达和干扰该反式作用因子的
条件下,做RT-PCR看目的基因的表达是否有变化.这个才能最后说明反式作用因子和顺式作
用元件结合后真的能够调控目的基因的表达,
对于以上很多的实验,选取细胞系是非常重要的,在不同的细胞系,目的基因的表达是
有区别的,因此,只有在某种细胞系才会得到理想的结果. 祝福螺友们好运!
基因启动子分析的基本流程就讲到这里！有任何问题欢迎螺友们继续跟帖讨论！