结果判断
当λ c在0.5λ ～2λ (包括0.5λ 和2λ ) 时，方可 用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ 为该批鲎试剂的 灵敏度。

目的 确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对
内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否 使用细菌内毒素检查法提供依据。
干扰试验


当进行新药的内毒素检查试验前，或无内 毒素检查项的品种建立内毒素检查法时， 须进行干扰试验。 当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变 或试验环境中发生了任何有可能影响试验 结果的变化时，须进行干扰试验。
。 制备含内毒素的供试品溶液
将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数 ，再用此稀释液将同支细菌内毒素标准品稀释成4 个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试 品溶液。
加样
0.1ml内毒素标准 液 2λ 0.1ml检查用水 阴性对照
பைடு நூலகம்
0.1ml含内毒素的 供试品液
2λ
0.1ml供试品液
例 制备稀释倍数为4的供试品阳性对照溶液 0.3ml4.0λEU/ml的内毒素标准溶液+0.3ml稀释倍数 为2的供试品稀释液=0.6ml含2λEU/ml内毒素标准 液的稀释倍数为4的供试品稀释液。 3、保温60±2分钟，观察并记录结果。
阴性
阳性
供试品
供试品阳性
4、当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，试验有效。当 系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2 管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰试验，此稀释 倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行 正式干扰试验。
鲎试剂灵敏度复核
0.2ml 1.8ml 0.3ml 0.5ml 1.5ml 1.95ml
150EU/ml
15EU/ml
2.0EU/ml
0.5EU/ml
1.2ml 1.2ml
1.2ml
0.6ml 0.6ml
1.2ml
0.25EU/ml
0.125EU/ml
0.0625EU/ml
细菌内毒素标准溶液的制备
仪器设备与实验器具
电热恒温干燥箱、恒温水浴锅、漩涡混合 器、试管架、镊子、剪刀、医用橡胶、消 毒棉球、砂轮、刻度吸管、凝集管、金属 饭盒。 目前已有多种无热原的一次性用品
实验器具的洗涤与除内毒素


实验中使用的所有玻璃器具一般经洗液浸 泡后，取出用自来水、 纯化水依次冲洗干 净（可用纯化水浸泡）。 实验中所使用的玻璃仪器清洁与否，直接 影响试验结果。


试验中所用的器皿，需要经过处理，除去 可能存在的外源性内毒素。常用的方法是 250℃干烤至少30分钟，达到规定时间后， 关断电源，待烤箱温度自然降至室温，一 般约需6～8 小时。 也可用其他适宜的方法，并应确证不干扰 细菌内毒素的检查。 除去外源性内毒素的玻璃器皿应在规定内 使用，否则须再次除去可能存在的外源性 内毒素。
由多糖、脂质和蛋白质组成的复合体。脂 多糖又由化学和生物性质不同的特异O 抗原、 核心多糖和类脂A（脂质A） 组成。

细菌内毒素
致热性 内毒素作用于人体细胞，使 之释放内源性热源，再刺激 下丘脑体温调节中枢，引起 发热反应。 多糖链有亲水性，脂肪链具 疏有水性，在水中呈不均匀 分布 强酸强碱水解反应
举例 某注射液限值为2.5EU/ml，按MVD=CL/λ计算出灵敏度为 0.03EU/ml下的MVD为83倍，将供试品溶液进行一系列稀 释，用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂预试验结果如下 稀释倍数 原液 5 10 20 40 80 供试品溶液 — — — — — — — — — — — — 供试品阳性对照— — — — — — + + + + + + 由以上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20倍 ，可在此浓度下进行正式干扰试验
干扰试验

进行干扰试验一般步骤
供试品限值确定 根据鲎试剂的限值确定MVD范围 预试验确定样品最大不干扰浓度 正式干扰试验

干扰试验预试验 目的 初步确定供试品的最大不干扰浓度或最小
不干扰稀释倍数，为正式干扰试验提供依据，避 免干扰试验的盲目性。
预试验
操作方法
1、将无可检查到内毒素的供试品进行一系列倍数的 稀释，但最大的稀释倍数不得超过 MVD=CL/λ0.03(0.03EU/ml为现今我国市售鲎试剂 的最高灵敏度)。 2、使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验，每一稀释 倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即 该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2λ浓 度）。另取2支内毒素检查用水作阴性对照，2支 加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。
供试品溶液的制备

某些供试品需进行复溶、稀释或在水溶性 溶液中浸提制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的PH值在6.0~8.0的范 围内。
可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH 值。


鲎试剂灵敏度复核
鲎试剂的标示灵敏度：在本检查法规定的条件
下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为 鲎试剂的标示灵敏度，其单位用EU/ml表示。
实验原理
——复杂的酶促反应过程
利用鲎试剂与微量内毒素产生凝聚反应的现 象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是 否符合规定的一种方法。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
实验试剂

鲎试剂 从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中
提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而 成的生物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低 有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml 当使用新批号的鲎试剂或实验条件发生可能影响检
M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量， 以ml/（kg· h）、mg/（kg· h）或（kg· h）表示，依 据药品使用说明书，《临床用药须知》确定。
最大有效稀释倍数

最大有效稀释倍数（MVD）指在实验中供试
品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释 倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。

MVD=CL/λ
λ
0.5λ 0.25λ
λ
0.5λ 0.25λ
阴性对照
加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避 免产生气泡，放入37±1°C恒温器中，保温 60±2分钟，观察并记录结果
式中L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶 液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于 1.0ml/ml，当L以EU/mg 或EU/U表示时，则C的单 位为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末 或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效 稀释浓度c= λ /L， λ 为在凝胶法中鲎试剂的标示 灵敏度（EU/ml）。
需建立内毒素检查项目的品种



质量标准中有家兔热原检查法需转换为细 菌内毒素检查方法的品种。 用于注射给药，但未有热原质量控制的品 种。 注射用新药需建立热原质量控制的品种。 用于静脉给药的原辅料
建立方法时对鲎试剂及样品的要求
同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂 每个品种至少三批样品（上市品种应检测两 个以上生产厂家；新药需检测连续生产的 样品）。
鲎试剂灵敏度复核
加样
2λ λ 0.5 λ 0.25 λ 阴性
鲎试剂灵敏度复核
加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀， 避免产生气泡，垂直放入细菌内毒素检查 专用干式恒温仪中，在37℃±1℃保温60分 钟±2分钟后，观察并记录结果。 结果观察
阳性
阴性
计算
试验结果中，如最大浓度2λ 管均为阳性，最低浓度 0.25λ 管均为阴性，阴性对照均为阴性，按下式计算反应终点浓度 的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值(λ c)。 λ c＝antilg(Σ X/4)
细菌内毒素检查法
定义：本法系利用鲎试剂来检测或量化由 革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断 供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定 的一种方法。
检查方法概述

凝胶法
限量试验 半定量试验

光度测定法
浊度法（终点浊度法和动态浊度法） 显色基质法（终点显色法和动态显色法）
凝胶法：最简单、经济、应用最广泛，中国药典 的“仲裁”方法
目的 考察鲎试剂的灵敏度是否准确、考察检验人
员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可 能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度 复核试验。
1、取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶 壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用 75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。 2、将细菌内毒素国家标准品或工作标准品用细菌内毒素 检查用水溶解 ，在旋涡混合器上混匀15分钟 ，然后根据 鲎试剂标示灵敏度(λ )，制成 2λ 、λ 、0.5λ 和0.25λ 4个 浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上 混匀30秒钟。 示例 某待复核的鲎试剂的灵敏度标示值为0.25EU/ml， 细菌内毒素工作标准品规格为150EU/ml，将细菌内毒素工 作标准品用1ml检查用水溶解，再稀释制备成浓度为 0.50EU/ml,0.25EU/ml,0.125EU/ml，和0.0625EU/ml的细 菌内毒素标准溶液。
5、当供试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素 与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大稀释 倍数（不得超过MVD=CL/λ0.03）或通过其他适宜的方 法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
干扰试验

正式干扰试验 制备内毒素标准对照液
取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水 稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ
细菌内毒素检查
主要内容
细菌内毒素检查相关理论及概念



细菌内毒素 实验原理 实验试剂 实验器具 供试品溶液的制备 内毒素限值的确定 最大有效稀释倍数（MVD）的确定 鲎试剂灵敏度复核 干扰实验 凝胶限度试验